張圣美,劉曉慧,尚 靜,張愛冬,朱宗文,朱月林

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,南京210095;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海201403)

花青素是一種天然的水溶性色素,位于植物細(xì)胞的液泡中[1],是花和果實(shí)的著色物質(zhì)[2],屬于酚類化合物中的類黃酮次級代謝產(chǎn)物[3]。 花青素能通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性抑制癌變、預(yù)防心腦血管疾病及糖尿病的發(fā)生[4]。 除此之外,花青素還可以幫助植物抵抗各種生物和非生物脅迫[5],研究表明,花青素含量較高的轉(zhuǎn)基因番茄植株耐熱性較強(qiáng)[6]。 花青素的合成一般分為三步,首先是苯丙氨酸作為前體物質(zhì)合成4-香豆酰CoA,這一階段的關(guān)鍵酶是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonialyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸輔酶A 連接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL);第二階段是合成二氫黃酮醇類物質(zhì),此階段是類黃酮物質(zhì)合成的關(guān)鍵階段,查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)是催化這一步的主要酶類;第三階段是在二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下形成各種花青素。 此時, 花青素還處于不穩(wěn)定的階段, 需要通過類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid 3-Oglucosyltransferase,3GT)糖基化反應(yīng)使花青素形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),進(jìn)而運(yùn)輸?shù)揭号葜匈A存起來[7]。

茄子(Solanum melongenaL.)屬于茄科茄屬,直立分枝草本至亞灌木,果皮中含有豐富的抗氧化性較強(qiáng)的花青素,具有很高的食用價值[8-9]。 茄子開花結(jié)果期的適宜溫度為25—30 ℃[10-11],超過35 ℃會對茄子的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響[12],造成其形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理狀態(tài)異常、品質(zhì)降低、產(chǎn)量減少[13],同時,高溫會通過削弱合成和增加分解的方式使植物中的花青素含量降低[14]。

目前關(guān)于高溫脅迫對茄子表皮花青素合成相關(guān)酶的影響方面的研究較少,本研究通過研究高溫對茄子果皮類黃酮和花青素濃度、花青素生物合成過程主要酶的活性以及相關(guān)酶基因的表達(dá)量的影響,探究高溫脅迫對茄子果皮花青素產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茄子(SolanummelongenaL.)品種為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主選育品種‘特旺達(dá)’。

1.2 試驗(yàn)處理

2018 年6 月25 日在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗(yàn)站播種,10 月30 日選擇生長期相近、果實(shí)生長量相似的茄子植株18 株,將其隨機(jī)分成3 組,每組6 株,移入人工氣候室內(nèi)進(jìn)行27 ℃(CK)、38 ℃和45 ℃處理。 各處理的光照時間為12 h 光照∕12 h 黑暗、光照強(qiáng)度為500 μmol∕(m2·s)、相對濕度為70%。 分別在處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、60 h 時削皮取樣,取樣時盡量少帶果肉,測定花青素、類黃酮的濃度,以及PAL、 CHS、 CHI 、DFR、 ANS 、UFGT 的活性。 每個處理3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 茄子果皮花青素、類黃酮濃度以及相關(guān)酶活性的測定

采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司),參考吳翠平[15]的方法,略加改動進(jìn)行測定。 將0.1 g 的茄子果皮用液氮研磨后加入0.9 mL 的0.05 mol∕L、pH 7.8 的磷酸緩沖溶液,1 000g、4 ℃離心20 min,取上清液。 酶標(biāo)板上的微孔包被著待測酶的抗體,將樣品作為抗原添加到微孔板中并加入樣品稀釋液和辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)結(jié)合物,37 ℃溫育,洗滌液洗滌5 次。 用底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)顯色,溫育15 min,加入1 mol∕L 的硫酸終止反應(yīng),450 nm 下測定吸光度(OD),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品花青素與類黃酮的濃度以及各個酶的活性。

1.3.2 花青素合成相關(guān)酶基因的qRT-PCR

使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取RNA,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性,使用微量核酸蛋白分析儀進(jìn)行濃度和純度的測定。 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,使用TB Green? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量,以上試劑均購自日本TAKARA 公司。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[16]進(jìn)行待測基因的選擇,目標(biāo)基因特異性引物見表1,以茄子PGK為內(nèi)參基因[17],由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成,使用Applied Biosystems Quantstudio 5(ABI,USA)進(jìn)行檢測,設(shè)置3 次重復(fù),使用2-ΔΔCt的方法[18]進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 基因的特異性引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0 軟件繪圖,SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對茄子果皮花青素和類黃酮含量的影響

圖1A 顯示,隨處理時間的延長,高溫脅迫下,花青素的含量呈不斷降低趨勢,與對照相比差異顯著,且45 ℃處理比38 ℃處理下降的幅度大。 38 ℃和45 ℃處理6 h 時,茄子果皮中花青素含量分別比處理0 h時低64.37%和69.99%,比CK 低65.72%和72.32%。

由圖1B 可知,隨著時間的延長,38 ℃和45 ℃處理下類黃酮含量呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢,且與CK 間差異顯著。 當(dāng)脅迫60 h 時,38 ℃處理類黃酮含量較對照下降了27.47%,45 ℃較對照下降了39.71%。當(dāng)處理48 h 和60 h 時,CK、38 ℃、45 ℃處理間的類黃酮含量呈顯著差異,說明高溫脅迫時間的延長會導(dǎo)致類黃酮含量下降。

2.2 高溫脅迫對茄子果皮PAL 活性的影響

由圖2 可知,隨著時間的延長,38 ℃條件下,PAL 活性呈先平緩后升高而后再下降的趨勢,24 h 時達(dá)到最大值,比CK 高16.93%。 在45 ℃條件下,PAL 活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,處理12 h 時達(dá)到最大值,較CK 高20.52%,比38 ℃條件下高8.91%。

2.3 高溫脅迫對茄子果皮CHS 和CHI 活性的影響

由圖3A 可知,隨著時間的延長,38 ℃和45 ℃高溫脅迫下CHS 活性呈下降的趨勢,在處理60 h 時最低,與CK 相比分別下降39.34%和51.34%。

查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的活性變化與CHS 活性變化相似,38 ℃高溫脅迫60 h 時較對照降低54.96%。45 ℃脅迫下,除處理0 h 和1 h 外,其余的處理時間下茄子果皮中CHI 活性均與CK 和38 ℃時有顯著差異(圖3B)。

2.4 高溫脅迫對茄子果皮中DFR、ANS、UFGT 酶活性的影響

如圖4A 所示,隨時間延長,在38 ℃高溫下,二氫黃酮醇還原酶(DFR)活性呈明顯下降趨勢,處理48 h和60 h 時分別較對照下降36.61%和47.24%。 45 ℃條件下,茄子果皮DFR 活性與CK 和38 ℃時相比顯著降低,隨著高溫處理時間的延長,DFR 活性也在不斷的降低,60 h 時達(dá)到最低值,比對照低73.24%。

圖4B 顯示,隨時間延長,高溫處理后的花青素合成酶(ANS)活性呈下降趨勢,45 ℃比38 ℃條件下下降的多。 除0 h 外,其余處理間差異顯著。 在處理60 h 時,38 ℃時較CK 減少了54.61%,較處理0 h減少了55.80%;45 ℃處理與CK 相比減少了71.15%,與0 h 相比減少了71.74%。

由圖4C 可知,隨時間的延長,高溫脅迫下UFGT 活性呈現(xiàn)出明顯下降趨勢,其中45 ℃較38 ℃條件下下降的多,且差異顯著,處理60 h 時,38 ℃條件下較處理0 h 下降了76.04%,較CK 下降了74.51%;45 ℃條件下,比未處理時下降了90.79%,比CK 下降了90.22%。

2.5 高溫脅迫對茄子果皮中花青素合成相關(guān)酶基因相對表達(dá)量的影響

由圖5 可知,處理3 h 時,SmPAL基因的表達(dá)量隨著溫度的升高逐漸升高;處理6 h 時,38 ℃和45 ℃下SmPAL基因的表達(dá)量均小于對照,且38 ℃時表達(dá)量更低。 在處理3 h 時,38 ℃條件下Sm4CL基因的表達(dá)量較對照高,45 ℃條件下與對照相比顯著上升;處理6 h 時,38 ℃與45 ℃時該基因的表達(dá)量均較對照顯著下降。SmCHI基因的表達(dá)量在處理3 h 和6 h 時顯示出相同的規(guī)律,在38 ℃時顯著升高,而在溫度達(dá)到45 ℃時其表達(dá)量降低到與對照相當(dāng)?shù)乃健?相同處理時間下,溫度越高,SmF3H、SmANS、SmUFGT基因的表達(dá)量越低。

3 結(jié)論與討論

杜丹妮等[19]研究表明,低溫會誘導(dǎo)花青素合成過程中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而使花青素的含量上升。而在高溫環(huán)境時,花青素的合成會受到抑制,羅蘭[20]研究發(fā)現(xiàn),花青素在細(xì)胞質(zhì)中是不穩(wěn)定的,會與糖苷鍵結(jié)合形成花青苷運(yùn)送到液泡中貯存,而高溫會使呼吸速率加快,當(dāng)植物體的碳水化合物儲備不足時,花青苷的糖苷鍵會發(fā)生水解以補(bǔ)充植物體所需能量,進(jìn)而抑制花青素的合成;YAMANE 等[21]發(fā)現(xiàn),高溫會抑制花青素合成的相關(guān)酶的活性,使花青素的合成減少,降解增多,從而使其含量顯著降低。 本研究結(jié)果表明,隨著高溫脅迫時間的延長,花青素的含量不斷下降,且與CK 之間存在顯著差異,其中45 ℃比38 ℃條件下下降多,表明較高的脅迫溫度與較長的脅迫時間,會加劇茄子果皮花青素含量的減少。

類黃酮是一類植物次生代謝物質(zhì),花青素屬于類黃酮物質(zhì)中的一種,一些關(guān)鍵酶的活性以及基因的表達(dá)量會直接影響到黃酮類化合物的合成和積累。 研究表明,適度低溫會促進(jìn)黃酮類化合物的累積[22],而高溫會導(dǎo)致黃酮的含量減少[23],與本研究結(jié)果一致。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代謝途徑的重要調(diào)控位點(diǎn),是合成花青素的限速酶,常作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)[24]。 吳雪霞等[25]研究表明,在高溫脅迫下,PAL 的活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。 Pan 等[26]研究表明,為減少熱脅迫對植物造成的傷害,PAL 的活性會增加,進(jìn)而使游離態(tài)SA 增加。陳雷等[27]研究表明,在植物受到溫度脅迫時,其PAL 活性會顯著上升,隨著脅迫時間的延長,其活性逐漸下降。 本試驗(yàn)中,在38 ℃及45 ℃高溫脅迫下,隨著時間的延長,PAL 的活性呈先上升后下降的趨勢,這與前人的研究結(jié)果一致,推測PAL 作用于花青素生物合成比較上游的位置,類黃酮的生物合成還存在其他分支路徑,PAL 活性與花青素的含量之間不存在顯著的相關(guān)性。

在花青素生物合成途徑第二階段中,CHS 和CHI 具有非常關(guān)鍵的作用,CHS 催化形成的查爾酮為類黃酮代謝提供碳架結(jié)構(gòu),研究表明,CHS基因過表達(dá)的擬南芥植株葉片會形成更多的花青素[28]。 CHI 可以將黃色查爾酮從容易離子化的雙環(huán)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)活性的無色三環(huán)結(jié)構(gòu)——黃烷酮[29]。 劉金花[30]發(fā)現(xiàn),在黃芩種子萌發(fā)和生長過程中,CHS 活性會隨著溫度的升高不斷下降,且在30 ℃左右時下降最多。 本試驗(yàn)結(jié)果表明,高溫會抑制查爾酮合成酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性,并且隨著脅迫時間的延長,其活性會呈不斷下降的趨勢。

花青素生物合成的第三階段涉及到三個比較關(guān)鍵的酶,DFR 可以催化二氫黃酮醇形成各種無色的花青素,ANS 將無色的花青素加氧轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩ㄇ嗨?然后由UFGT 催化形成花青素苷[31]。 研究發(fā)現(xiàn),紫心甘薯DFR 活性與花青素的合成密切相關(guān),當(dāng)DFR 活性較高時,花青素的含量也較高,反之,當(dāng)DFR 的活性下降時,花青素的含量也會降低,其作為關(guān)鍵酶參與到了甘薯花色苷的代謝活動中[32]。 吳雪霞等[25]研究表明,高溫會降低DFR、ANS、UFGT 活性。 李小蘭等[33]發(fā)現(xiàn)溫度是調(diào)控ANS 表達(dá)的重要環(huán)境因子之一,推測在高溫下合成的花青素較低溫少。 李智[34]研究證實(shí)高溫使ANS基因的表達(dá)受到抑制,從而使花青素的合成量減少,Huh 等[35]研究表明ANS的表達(dá)水平受高溫的影響比較大。 隨著夜間溫度的升高,與花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)以及UFGT 的活性會受到抑制[36]。 本研究表明,在高溫脅迫下,DFR、ANS 和UFGT 活性均隨著脅迫溫度的升高和脅迫時間的延長不斷降低。

溫度是對花青素合成相關(guān)基因表達(dá)量產(chǎn)生影響的一個重要的因素[37],高溫會使關(guān)鍵酶基因的表達(dá)受到抑制[38],Liu 等[14]報道花青素的生物合成過程中相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因可以分為早期基因和晚期基因,CHS、CHI、F3H屬于早期基因,而DFR、ANS、UFGT屬于晚期基因,早期基因的表達(dá)與花青素的含量之間沒有顯著的相關(guān)性,而晚期基因是合成特定類黃酮所必需的,其基因的表達(dá)水平與花青素的含量呈正相關(guān)。 本研究表明,SmPAL和SmCHI基因的表達(dá)量與花青素的含量變化不一致,而Sm4CL、SmANS、SmUFGT則同花青素的含量變化趨勢一致。 這可能是由于早期基因不僅要參與花青素的合成,同時也參與其他分支階段,如木質(zhì)素的合成所導(dǎo)致的。

綜上,高溫降低花青素合成途徑中關(guān)鍵酶的活性以及一些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量,進(jìn)而使得花青素與類黃酮的含量降低。