朱紅芳,李曉鋒,吳 軒,臧曉韻,朱玉英

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201106)

溫度是植物生長發(fā)育過程中的重要環(huán)境條件,對植物生長發(fā)育和蔬果貯存具有極大的作用。 溫度的高低不僅影響植物的生長,而且對植物體內(nèi)的滲透物質(zhì)、活性氧、抗氧化酶系統(tǒng)和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯影響[1]。 低溫脅迫常造成植物苗弱,植株生長緩慢且產(chǎn)量低、品質(zhì)差[2];而持續(xù)的高溫脅迫則會使植物失水萎蔫,葉片枯黃脫落。 研究發(fā)現(xiàn),麻竹[3]、大白菜[4]、大豆[5]和黃瓜[6]的抗氧化酶系統(tǒng)在受到不同溫度脅迫時(shí)會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而活性增加。

不結(jié)球白菜(Brassica rapa.ssp.chinensis)屬十字花科蕓薹屬白菜亞種,又名青菜、小白菜、油菜等,以嫩葉為產(chǎn)品,品質(zhì)柔嫩、營養(yǎng)豐富,具有生長期短、適應(yīng)性廣的特點(diǎn),在我國長江中下游及其以南地區(qū)受到人們的喜愛[7]。 不結(jié)球白菜是一種喜冷涼性蔬菜,適宜的生長溫度為18—25 ℃,溫度過低或過高均會對其產(chǎn)生一定的影響。 紫色不結(jié)球白菜因富含高抗氧化的花青素而倍受青睞[8],然而花青素極易受到溫度、光照等環(huán)境因素的影響,在生產(chǎn)栽培過程中紫色不結(jié)球白菜葉片中花青素的積累受高溫和低溫的影響較大,冬季栽培中因低溫而積累花青素,但生長緩慢,產(chǎn)量低下;在夏季高溫栽培中則因高溫花青素降解,造成紫色不結(jié)球白菜栽培品種外觀色澤和品質(zhì)不佳。 在前期的試驗(yàn)中,本課題組發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫處理12 d 后,紫色不結(jié)球白菜葉片紫色加深,呈深紫色,花青素含量顯著增加,且蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)、抗壞血酸等營養(yǎng)品質(zhì)提高,而在35 ℃高溫處理12 d,花青素含量急劇降低,葉片呈綠色,品質(zhì)降低[9]。

本試驗(yàn)以紫色不結(jié)球白菜新品種‘紫藝’為材料,研究不同溫度處理下其幼苗中蛋白質(zhì)、脯氨酸等滲透物質(zhì)含量,以及活性氧和抗氧化酶活性的變化,探索溫度調(diào)控其生理生化的機(jī)制,以期為紫色不結(jié)球白菜的種植栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為紫色不結(jié)球白菜新品種‘紫藝’,由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所青菜課題組選育。該品種直立性強(qiáng),葉形橢圓,呈紫紅色,表面平滑,有光澤,葉背面可見縱橫交錯的紫色葉脈,具有抗霜霉病和病毒病、耐寒性強(qiáng)、風(fēng)味濃郁等特點(diǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017 年5—8 月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所溫室內(nèi)進(jìn)行,種子播種于容積為15 cm×10 cm×10 cm 的塑料營養(yǎng)缽中。 待植株長到四葉一心時(shí),選擇生長勢基本一致的試驗(yàn)用苗隨機(jī)分成3組,放在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi),以適宜溫度25 ℃為對照,設(shè)定高溫35 ℃和低溫5 ℃處理,光照強(qiáng)度均為80 000 lx,濕度均為60%。 分別在處理0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 時(shí)取樣,不同處理選取5 株大小一致的植株,每株選擇離心葉第三片功能葉片,去掉葉柄,將葉片剪碎混勻,分裝樣品,測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定

按照李合生[10]的方法測定脯氨酸含量,采用硫代巴比妥酸法(TCA-TBA)測定丙二醛(MAD)含量,采用超氧根陰離子(O2·-)對羥胺氧化方法測定O2·-產(chǎn)生速率。

抗氧化活性的測定:酶液的提取按照王愛國等[11]的方法,提取液為0.05 mol∕L、pH 7.8 的PBS,含0.2 mmol∕L EDTA 和1% PVP(冰箱保存)。 將0.1 g 不結(jié)球白菜葉片置于預(yù)冷研缽中,分次加入預(yù)冷的提取液1.6 mL,冰浴下研磨成勻漿,放入離心管中,4 ℃低溫下12 000 r∕min 離心20 min。 上清液即為所需粗酶液,低溫保存。 采用氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[12];采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[10];采用過氧化氫比色法測定過氧化氫酶(CAT)活性[10],抗壞血酸氧化物酶(APX)活性按照Nakano 等[13]方法測定。

谷胱甘肽還原酶(GR)活性及還原性抗壞血酸(AsA)、還原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量的測定參照郭欣欣等[14]方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS 20.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,并用Origin 9.5 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對紫色不結(jié)球白菜‘紫藝’脯氨酸含量的影響

脯氨酸以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中,可以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)[15]。 由圖1 可見,在25 ℃條件下,從0 d到12 d,‘紫藝’脯氨酸含量在51.38—54.91 μg∕mL FW 之間變動,平均值為53.06 μg∕mL FW。 當(dāng)溫度為35 ℃時(shí),脯氨酸含量呈先增后減的趨勢,在8 d 時(shí)達(dá)到最大值63.47 μg∕mL FW,而后降至60.1 μg∕mL FW。 當(dāng)溫度為5 ℃時(shí),脯氨酸含量持續(xù)上升,在12 d 時(shí)達(dá)到最大值76.92 μg∕mL FW,與0 d時(shí)相比,脯氨酸含量提高了31.20%。

2.2 不同溫度對紫色不結(jié)球白菜‘紫藝’活性氧的影響

活性氧包括過氧化氫(H2O2)、超氧根陰離子(O2·-)等幾種形式,其中H2O2是相對穩(wěn)定的一種活性氧,也是一種有效的信號分子,植物在生長發(fā)育過程中受到脅迫時(shí),可以通過H2O2提高免疫,增強(qiáng)植物對非生物脅迫的抵抗能力[16]。 在適宜的25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’H2O2含量平均為6.32 μg∕mL FW;在35 ℃條件下,從0 d 到12 d,H2O2含量呈緩慢增高趨勢,在0—4 d 和8—12 d 增長較明顯,4—8 d 增長不明顯。 在5 ℃低溫條件下,從0 d 到12 d,H2O2含量先增高后降低,在8 d 時(shí)達(dá)到最大值11.02 μg∕mL FW,隨后緩慢下降(圖2A)。

超氧陰離子作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基,具有很強(qiáng)的氧化性,可致組織損傷。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’O2·-產(chǎn)生速率平均值為0.94 μmol∕(g·min);在35 ℃高溫下,從0 d 到12 d,O2·-產(chǎn)生速率呈先增高后降低趨勢,在8 d 時(shí)達(dá)到最大值1.62 μmol∕(g·min),12 d 時(shí)O2·-產(chǎn)生速率為1.34 μmol∕(g·min);在低溫5 ℃時(shí),O2·-產(chǎn)生速率呈先增后減趨勢,在10 d 時(shí)達(dá)到最大值,12 d 時(shí)為1.64 μmol∕(g·min)(圖2B)。

2.3 不同溫度對紫色不結(jié)球白菜‘紫藝’抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶(POD)是一種高活性的氧化還原酶,與植物呼吸、光合作用、生長素的氧化和木質(zhì)素的形成有關(guān),其活性隨植物生長發(fā)育和環(huán)境條件的變化而變化。 在適宜的25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’POD 活性平均值為8.61 μmol∕(g·min) FW,變化不顯著;在5 ℃時(shí),POD 活性呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢,從0 d 到12 d,POD 活性由8.52 μmol∕(g·min) FW 增長至9.68 μmol∕(g·min) FW,增加了13.62%;在35 ℃時(shí),從0 d 到12 d,POD 活性呈持續(xù)下降趨勢,且在8—10 d 迅速下降,從7.66 μmol∕(g·min) FW 降至6.52 μmol∕(g·min) FW(圖3A)。

超氧化物歧化酶(SOD)是一種抗氧化金屬酶,具有特殊的生理活性,能夠清除生物體內(nèi)的有害自由基。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’SOD 活性平均值為113.36 μmol∕(g·min) FW;在35 ℃條件下,SOD 活性呈先增后降趨勢,從0 d 到10 d 持續(xù)升高,在10 d 時(shí)到達(dá)最大值190.25 μmol∕(g·min) FW,之后下降;低溫5 ℃時(shí),SOD 活性隨時(shí)間逐漸增強(qiáng),從0 d 的111.25 μmol∕(g·min) FW 增加到12 d 的176.11 μmol∕(g·min) FW(圖3B)。

過氧化氫酶(CAT)是一種末端氧化酶,其生物學(xué)功能是催化過氧化氫在細(xì)胞內(nèi)分解為過氧化氫和氧氣,并抑制過氧化氫形成有害的·OH。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’CAT 的活性平均值為59.98 μmol∕(g·min) FW;在35 ℃條件下,從0 d 到12 d,CAT 活性呈先增后減的趨勢,在8 d 時(shí)到達(dá)最高的137.35 μmol∕(g·min) FW,12 d 時(shí)CAT 活性為116.96 mol∕(g·min) FW;在低溫5 ℃時(shí),CAT 活性隨時(shí)間緩慢增強(qiáng),從0 d 到12 d,CAT 活性由58.14 μmol∕(g·min) FW 增加至88.14 μmol∕(g·min) FW(圖3C)。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)是清除植物體內(nèi)活性氧和抗壞血酸代謝的關(guān)鍵抗氧化酶之一。APX 通過H2O2催化氧化,消化AsA。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’ APX 活性平均值為0.52 μmol∕(g·min) FW;在高溫35 ℃時(shí),從0 d 到12 d,APX 活性呈先增后減的趨勢,在6 d 時(shí)達(dá)最高的0.84 μmol∕(g·min) FW,12 d 時(shí)APX 活性為0.66 μmol∕(g·min) FW;在低溫5 ℃下,APX 活性隨時(shí)間逐漸增強(qiáng),從0 d 的0.53 μmol∕(g·min) FW 增加到12 d 的1.98 μmol∕(g·min) FW(圖3D)。

2.4 不同溫度對紫色不結(jié)球白菜‘紫藝’抗壞血酸-谷胱甘肽的影響

抗壞血酸又稱維生素C,AsA 為還原型抗壞血酸,是衡量農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’AsA 含量平均值為480.77 μmol∕g FW,在445.45—517.64 μmol∕g FW 之間變動;在5 ℃低溫下,AsA 含量先降低后增加,從0 d 的430.86 μmol∕g FW 先降低至415.88 μmol∕g FW后,再增加至12 d 的623.53 μmol∕g FW;在35 ℃高溫下,AsA 含量從0 d 的438.77 μmol∕g FW 逐漸降低,12 d時(shí)AsA 含量降為403.14 μmol∕g FW(圖4A)。

谷胱甘肽還原酶(GR)是一種將氧化型谷胱甘肽還原成還原型谷胱甘肽的黃素蛋白氧化還原酶。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’ GR 活性平均值為312.33 nmol∕(g·min) FW,在305.52—325.75 nmol∕(g·min) FW 之間變動;在5 ℃低溫時(shí),GR 活性隨時(shí)間逐漸增加,從0 d 到12 d,GR 活性由330.64 nmol∕(g·min) FW 增加至530.64 nmol∕(g·min) FW;在35 ℃高溫下,GR 活性呈先增后減的趨勢,從301.44 nmol∕(g·min) FW 延長緩慢增加至10 d 時(shí)的379.24 nmol∕(g·min) FW,隨后下降(圖4B)。

還原型谷胱甘肽(GSH)具有抗氧化和抗御各種外源脅迫,以及清除過量活性氧和維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的功能。 在25 ℃條件下,從0 d 到12 d,‘紫藝’GSH 含量平均值為1.57 μmol∕g FW,在1.50—1.63 μmol∕g FW 之 間 變 動; 在5 ℃條 件 下, GSH 含 量 逐 漸 降 低, 從1.63 μmol∕g FW 降 低 至0.78 μmol∕g FW;在35 ℃條件下,GSH 含量從1.65 μmol∕g FW 逐漸降低為1.04 μmol∕g FW(圖4C)。

氧化谷胱甘肽(GSSG)在還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽還原酶共存的情況下對自由基清除具有協(xié)同催化作用,GSH∕GSSG 值對自由基清除率有明顯的影響。 在25 ℃條件下,從0 d 至12 d,‘紫藝’GSSG 含量在23.88—20.65 μmol∕g FW 之間變動,平均值為22.32 μmol∕g FW;在5 ℃條件下GSSG 含量先增加后降低,由20.58 μmol∕g FW 增加至8 d 的28.54 μmol∕g FW,12 d 時(shí)降低為26.77 μmol∕g FW;在35 ℃條件下,GSSG 含量從24.23 μmol∕g FW 逐漸增加至64.16 μmol∕g FW(圖4D)。

3 討論與結(jié)論

溫度的變化在一定程度上刺激了植物細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞膜中不飽和酸、活性氧和脯氨酸含量增加。本試驗(yàn)中紫色不結(jié)球白菜葉片中脯氨酸含量在低溫條件下呈上升趨勢,在高溫下呈先增后減趨勢,H2O2在低溫和高溫脅迫下均呈現(xiàn)上升趨勢,O2·-在低溫和高溫下均呈現(xiàn)先增后減的趨勢,這與寧露云等[17]和寇剛[18]研究一致。

低溫脅迫刺激組織、細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng),抗氧化酶活性增強(qiáng)或降低,從而提高組織、細(xì)胞抵御低溫脅迫的能力[19]。 在高溫脅迫下,隨著SOD 活性的下降,白菜中POD 活性卻逐漸增加,而過氧CAT 活性則出現(xiàn)先下降后上升的變化[20]。 本試驗(yàn)中紫色不結(jié)球白菜葉片中POD 活性在低溫下呈下降趨勢,高溫下則呈上升趨勢;SOD 和CAT 活性在低溫和高溫下變化趨勢一致,在低溫下均逐漸升高,在高溫下則先升后降;APX 活性在低溫下逐漸增加,在高溫下呈先增后減趨勢,這與黃瓜[21]和番茄[22]研究結(jié)果一致。 由于APX 是植物AsA 的主要消耗者,因此AsA 含量變化依據(jù)APX 活性的強(qiáng)弱變化,兩者呈一定的負(fù)相關(guān)性。谷胱甘肽還原酶以還原型輔酶Ⅱ?yàn)槲ㄒ坏倪€原力和電子供體催化還原型谷胱甘肽從氧化型谷胱甘肽中還原。 在溫度的影響下,GR 活性增加,GSSG 含量增加,而GSH 含量下降。 本試驗(yàn)中AsA 含量在低溫下先增后降,在高溫下呈下降趨勢;GR 含量在低溫下呈上升趨勢,在高溫下呈先增后降趨勢;GSH 含量在低溫和高溫下持續(xù)下降;GSSG 含量在低溫下呈先增后減趨勢,在高溫下持續(xù)增加,這與張騰國等[23]的研究一致。

綜上所述,通過在不同溫度條件下對紫色不結(jié)球白菜生理生化指標(biāo)的測定和分析,發(fā)現(xiàn)高溫和低溫均會誘導(dǎo)不結(jié)球白菜植物體內(nèi)活性氧增加,使抗氧化酶系統(tǒng)和谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),從而提高植物抵抗溫度變化的脅迫能力。 本研究明確了紫色不結(jié)球白菜受溫度影響下生理生化機(jī)制的調(diào)節(jié),可為紫色不結(jié)球白菜的栽培種植提供一定參考。