張 琪,張皖靜,張曉霞,趙悅琪,吳文靜,袁文天,許 燕*,趙 凱

(1 上海師范大學生命科學學院,上海200234;2 上海博滿生物科技有限公司,上海201106;3上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所,上海201106)

豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是單股負鏈DNA 病毒,直徑約17 nm,是現(xiàn)階段最小的動物病毒[1-3]。 由PCV2 病毒引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)發(fā)病迅速,流傳廣泛,病豬難以治愈且死亡率高,對國內(nèi)乃至全世界的養(yǎng)豬業(yè)危害極大[4]。 PCV2 常常與某些病毒混合感染,如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、弓形體、附紅細胞體等,可促進相關(guān)疾病的發(fā)作。 PMWS 典型癥狀包括進行性消瘦、呼吸困難、厭食、精神不振、毛發(fā)蓬亂,且20%的豬出現(xiàn)黃疸[4-6]。 肉眼檢查腸系膜及腹股溝淋巴異常腫大和肺部灰褐色炎癥病變最常見,其他一些器官如肝、脾、胰、胃、小腸和結(jié)腸也常見腫大及壞死病變[7-8]。 由于PCV2 嚴重破壞豬的免疫系統(tǒng),引起免疫力低下,一旦豬體內(nèi)存在其他病毒或細菌、原蟲感染,就會暴發(fā)流行。 目前該病已廣泛流行于美國、法國、中國、韓國等國家,給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成的損失巨大[9-10]。

目前用于PCV2 的檢測方法主要由3 種,分別是常規(guī)PCR、ELISA 和基因芯片檢測[11-13]。 PCR 技術(shù)是一種常規(guī)的分子生物學檢測技術(shù),但易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[11]。 ELISA 檢測有局限性,檢測過程嚴格、復(fù)雜,需要專業(yè)設(shè)備和專業(yè)人員在專業(yè)實驗室內(nèi)進行,靈敏度較低,無法在現(xiàn)場進行檢測[12]。 目前普遍看好的基因芯片技術(shù)存在難以推廣應(yīng)用的障礙,如基因芯片檢測成本高、芯片制作系統(tǒng)昂貴,且需要激光共聚焦掃描儀,限制了芯片技術(shù)的應(yīng)用[13]。 因此,需要開發(fā)出一種快速、簡便、靈敏和精確的方法檢測PCV2 病毒。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)針對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計4 條特異引物,利用鏈置換Bst DNA 聚合酶,在恒溫65 ℃左右,約60 min,即可擴增出LAMP 特征性梯狀條帶[14-16]。 LAMP 檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點:特異性比PCR 強;靈敏度比PCR 高10 倍;速度快,需40 min 即可;成本低,易推廣;產(chǎn)物檢測便捷,可以進行現(xiàn)場可視化快速檢測[17-19]。 該技術(shù)對儀器沒有特殊要求,只需金屬浴便可完成整個反應(yīng)過程,而且操作簡單,易于基層推廣[20-21]。 本實驗室已研發(fā)了豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)LAMP 現(xiàn)場可視化快速檢測試劑盒,本試驗擬進一步對該試劑盒的原材料進行研究,以實現(xiàn)試劑盒檢測性能的最優(yōu)化,為PCV2 LAMP 現(xiàn)場可視化定性檢測技術(shù)的藥證申報奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

陽性參考品:豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)病毒;陰性參考品:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬瘟病毒(CSFV);均由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2 主要試劑

配套試劑(25 mmol∕L dNTP、 LAMP 反應(yīng)緩沖液、Bst 酶)分別購自南京諾唯贊生物科技有限公司(諾維贊)、上海閃晶生物有限公司(閃晶)和北京藍譜生物科技有限公司(藍譜)。

病毒基因組DNA∕RNA 提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司; CFI 染料為上海博滿生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 PCV2 靶基因序列的選擇

首先從NCBI 數(shù)據(jù)庫找出一系列PCV2 毒株的基因序列,再通過DNAMAN 比對找到PCV2 的保守區(qū),將保守區(qū)的序列進行BLAST,選擇可能符合要求的特異性序列。 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中以O(shè)RF2 基因為關(guān)鍵詞檢索已公布PCV2 的BJ0804 株全序列,選擇ORF2 基因(GenBank:EU921257)的保守區(qū)作為靶序列,全長233 bp。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)PCV2 ORF2 靶基因,通過Primer Explorer V5 軟件分析,設(shè)計選擇3 對引物(表1),LAMP 擴增之后觀察擴增條帶的亮度和清晰度情況,并最終選擇了1 對最佳引物。

表1 PCV2 LAMP 反應(yīng)擴增引物Table 1 LAMP detection primers of PCV2

1.5 PCV2 LAMP 檢測試劑盒的組裝和使用

PCV2 LAMP 檢測試劑盒主要包括A 液和B 液,為了防止污染,試驗過程在不同區(qū)域進行。

(1)在實驗室一中將A 液(FIP∕BIP 或F3∕B3 或LF∕LB,25 mmol dNTP,CFI 染料,Bst 酶)混合風干于PCR 管蓋;然后將B 液(ddH2O,10 ×buffer,100 mmol Mg2+)加入PCR 管內(nèi),封蓋(蓋緊),做成半成品,封裝。

(2)將實驗室一配置好的體系帶入實驗室二,B 液加入相應(yīng)的陽性模板,換上在實驗室一配置的帶有吹干試劑A 液的管蓋。 倒置2 min,上下顛倒5 次,以充分將PCR 管里的試劑與管蓋上吹干的試劑混勻。

(3)將加好模板的PCR 管放入金屬浴61 ℃、40 min 進行擴增,反應(yīng)結(jié)束,可直接觀察顏色變化;也可將擴增產(chǎn)物放在熒光顯色儀(蘇州優(yōu)科生物技術(shù)有限公司)下觀察熒光。

在基于LAMP 技術(shù)的豬PCV2 現(xiàn)場可視化定性快速檢測方法上,選擇LAMP 反應(yīng)的最優(yōu)條件進行試驗。

1.6 試劑盒標準陽性對照的制備

用設(shè)計好的引物PCV2-F3∕B3 進行PCV2 病毒DNA 的PCR 擴增,擴增產(chǎn)物的回收與純化按照天根生化科技(北京)有限公司試劑盒的說明書操作。 將純化的產(chǎn)物與載體pMD18-T vector 連接,轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞中培養(yǎng),對陽性克隆進行鑒定,測序后使用天根生化科技(北京)有限公司質(zhì)?？焖俪樘嵩噭┖刑崛≠|(zhì)粒,并測其含量,按照病毒學方法計算對應(yīng)的拷貝數(shù),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用PCV2 LAMP 檢測試劑盒檢測40 例豬血清樣品,將陽性血清和陰性血清分開保存,將陽性血清的顯色結(jié)果與PCV2 病毒質(zhì)粒的顯色結(jié)果進行比對,選擇與陽性血清顯色結(jié)果同樣清晰明亮的質(zhì)粒濃度作為陽性對照模板。 首先將抽提的質(zhì)粒進行一系列的濃度梯度稀釋,然后對每個濃度梯度的質(zhì)粒模板進行LAMP 擴增,與40 例豬血清中的陽性血清顯色結(jié)果進行比對,挑取顯色結(jié)果較好的質(zhì)粒含量作為陽性對照。

1.7 空白對照制備

空白對照為無RNA 酶的水,用移液器量取1 mL 的DEPC,補純化水至1 000 mL 混勻,然后在滅菌鍋中121 ℃、20 min 高溫高壓滅菌,室溫保存。

1.8 Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液的比對研究

將3 家公司的Bst 酶、dNTP 和LAMP 反應(yīng)緩沖液按LAMP 反應(yīng)體系的用量進行配制,分別加入含量為1 ×104拷貝∕μL 的PCV2 DNA,進行LAMP 檢測,重復(fù)3 次。 根據(jù)電泳結(jié)果和顯色指示進行分析,評價3 家公司的Bst 酶、dNTP 和LAMP 反應(yīng)緩沖液對LAMP 反應(yīng)的影響。

1.9 Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液質(zhì)量鑒定研究

選擇試驗結(jié)果較好的公司的Bst 酶,用于LAMP 擴增反應(yīng)體系。 按照本企業(yè)《原材料檢驗作業(yè)指導(dǎo)書》,以陽性對照為模板,進行LAMP 擴增,觀察LAMP 擴增結(jié)果,重復(fù)3 次。

1.10 試劑盒陰性參考品和陽性參考品的制備與試驗

陽性參考品:取200 μL PCV2 病毒培養(yǎng)液的母液提取DNA。 按梯度稀釋,梯度為10-1(1010個病毒∕μL)至10-13(1 個病毒∕μL),稀釋后分別進行LAMP 檢測,重復(fù)3 次。

陰性參考品:取200 μL PRV、SFV 和PRR 病毒培養(yǎng)液的母液提取DNA,分別進行LAMP 檢測,重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒標準陽性對照的制備

從40 例豬血清樣品中鑒別出24 例陽性血清,將24 例陽性血清的PCV2 LAMP 顯色結(jié)果與含量不同的質(zhì)粒(梯度稀釋)的PCV2 LAMP 顯色結(jié)果進行比對,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒含量為1 ×104拷貝∕μL 的顯色結(jié)果與陽性血清的顯色結(jié)果較接近,所以選擇含量為1 ×104拷貝∕μL 的質(zhì)粒作為陽性對照。

2.2 Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液的比對

根據(jù)LAMP 擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果和顯色指示(圖1),LAMP 擴增產(chǎn)物電泳梯狀條帶清晰度和亮度越高越好,擴增產(chǎn)物的顏色變化越明顯越好。 在諾維贊、閃晶、藍譜3 家公司樣本中,第5—6 組(諾維贊)LAMP 擴增產(chǎn)物電泳梯狀條帶清晰度最好,條帶亮度最高,且在染料CFI 作用下顏色變化最明顯。 綜合比較,諾維贊的Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液擴增效果較好,因此選擇該公司的試劑。

2.3 Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液質(zhì)量鑒定

將諾維贊所生產(chǎn)的Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液用于LAMP 擴增反應(yīng)體系,進行多次重復(fù)驗證。 如圖2所示,其陽性對照顯色結(jié)果為藍色,陰性對照為紫色;在熒光顯色儀下,陽性呈綠色,陰性呈橙色,表明Bst酶在LAMP 擴增中重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。

2.4 試劑盒陽性參考品研究

如圖3 所示,LAMP 檢測中,陽性參考品10-1(1010個病毒∕μL)—10-11(5 個病毒∕μL)和陽性對照的顏色為藍色,熒光顯色儀下為綠色;陽性參考品10-12(2 個病毒∕μL)—10-13(1 個病毒∕μL)和陰性對照的顏色沒有變化,為紫色,熒光顯色儀下為橙色,說明陽性參考品稀釋度為10-11(5 個病毒∕μL)可進行反應(yīng),靈敏度較高。

2.5 試劑盒陰性參考品研究

如圖4 所示,LAMP 擴增反應(yīng)中陰性參考品和陰性對照均無擴增,肉眼觀察為紫色,熒光顯色儀下為橙色;陽性對照肉眼觀察為藍色,熒光顯色儀下為綠色,說明陰性參考品特異性好,選擇合適。

3 結(jié)論與討論

PCV2 病毒傳播方式多樣,不僅在環(huán)境中大量存在,而且在動物體內(nèi)也是廣泛分布,各種組織包括血液、精液均可以檢測出PCV2,再加上PCV2 主要侵害豬的淋巴細胞,破壞免疫系統(tǒng),導(dǎo)致PCV2 防控難度增加[22]。 目前,用來檢測PCV2 病毒的技術(shù)有很多,本試驗采用的LAMP 技術(shù)是一種新型的基因擴增技術(shù),近年來在動物疫病快速診斷中起著重要作用[23-24]。

本研究按照如下條件來選擇用于LAMP 檢測PCV2 的靶基因:PCV2 特異性的靶基因,其他生物沒有該同源序列的基因,或者存在可檢測區(qū)分的基因突變位點。 首先下載一系列不同毒株的靶基因序列進行比對分析,找出靶基因的保守區(qū);同時用BLAST 對設(shè)計的引物序列進行了同源性分析,以保證引物可以特異擴增。 在Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液的比對研究中,對比了3 家不同公司的試劑,發(fā)現(xiàn)諾維贊的試劑效果較好;在Bst 酶和LAMP 反應(yīng)緩沖液質(zhì)量鑒定研究中,選擇的Bst 酶在LAMP 反應(yīng)過程中能夠有效地工作,穩(wěn)定性高、重復(fù)性好;在陽性參考品研究結(jié)果中,陽性參考品的顏色變化明顯,熒光顯色中,陽性參考品和陰性對照顯色區(qū)別明顯,陽性參考品的靈敏度較高,選擇合適;在試劑盒陰性參考品研究結(jié)果中,3 種病毒參考品都未出現(xiàn)顏色變化,熒光顯色中,陰性參考品與陽性對照顯色差別明顯,說明陰性參考品的特異性好,選擇合適。

本研究建立了基于LAMP 的豬PCV2 現(xiàn)場可視化定性檢測方法。 在此檢測方法的基礎(chǔ)上,優(yōu)化之后的LAMP 檢測法能對PCV2 進行可視化、現(xiàn)場快速檢測,同時該檢測方法具有特異性強、靈敏度高、省時快速、操作簡單、經(jīng)濟實用、儀器簡單且無需專業(yè)人員進行操作的特點。 與許宗麗等[25]建立的LAMP 檢測方法相比,本研究在引物中增加了環(huán)形引物,LAMP 反應(yīng)時間減半;因為LAMP 檢測法對生物樣品的耐受性優(yōu)于其他檢測方法,豬血清可直接作為模板,省去DNA 提取步驟。 此外,在配置體系過程中,將試劑A 混勻吹干在PCR 管的管蓋上,最大程度地保護了試劑的活性,保存時間長,室溫可存放7 個月,可常溫運輸,避免了冷鏈運輸;試劑B 封裝于PCR 管中,只需加樣一次,在反應(yīng)之前加入染料,DNA 擴增后,無需開蓋,可直接顯色可視化判斷結(jié)果,減少了污染風險;試驗結(jié)果可通過雙顯色系統(tǒng)進行鑒別;設(shè)備簡單,只需一臺金屬浴。 本研究建立的檢測方法可用于養(yǎng)殖場和基層檢測機構(gòu)的臨床檢測。

本試驗對LAMP 檢測技術(shù)進行了主要原材料的研究,后期將繼續(xù)進行相關(guān)研究,如試劑盒參考值研究、分析性能評估、技術(shù)要求、穩(wěn)定性、工藝及反應(yīng)體系研究分析等,并申報藥證。 本研究可為其他相關(guān)LAMP 試劑盒的藥證申報提供參考。