劉澤輝,宣巖芳*,雷胡龍,黃志英,凌 超,趙志輝**

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,上海201403;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106)

維生素D 是動物機體維持正常生命活動所必須的營養(yǎng)素之一,不僅能調(diào)節(jié)機體鈣磷代謝、促進骨骼發(fā)育[1],而且具有重要的抗氧化[2]和免疫調(diào)節(jié)功能[3-4],還有研究表明飼料中添加維生素D3可提高畜禽生產(chǎn)性能[5-6]、改善肉品質(zhì)[7]。

飼料中添加的維生素D3主要有兩種形式:維生素D3(又名膽鈣化醇)和25-羥基維生素D3(又名骨化二醇)。 25-羥基維生素D3是維生素D3的活性形式。 被腸道吸收的維生素D3首先在肝臟中發(fā)生C25 羥基化,生成25-羥基維生素D3,并在腎臟線粒體中進一步轉(zhuǎn)化為1,25-二羥基D3后被轉(zhuǎn)運至小腸粘膜,促進鈣磷吸收[6]、沉積和鈣蛋白質(zhì)的合成[8-9]。 25-羥基維生素D3不僅具有普通維生素D3的全部功能,還具有以下優(yōu)勢:作為一種活性形式吸收后不需要經(jīng)過肝臟代謝和轉(zhuǎn)化,直接供人或動物利用,縮短了維生素D3在機體的代謝過程,其生物學(xué)效價更高[7];25-羥基維生素D3具有更強的生理活性,參與了免疫細(xì)胞分化與功能調(diào)節(jié),其在血漿中的含量是維生素D3營養(yǎng)狀態(tài)的重要標(biāo)志[10]。 因此,25-羥基維生素D3是飼料中更為有效的維生素D3的添加形式,并于1995 年獲得美國食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證,經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)可以在畜禽飼料中使用的新型營養(yǎng)性添加劑。 我國于2014 年2 月1 日將其列入《飼料添加劑品種目錄(2013)》(原農(nóng)業(yè)部公告第2045 號),允許作為飼料添加劑使用。

目前,25-羥基維生素D3在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用十分廣泛,在畜禽飼料生產(chǎn)中也多直接添加25-羥基維生素D3。 但是值得注意的是其生物學(xué)活性高的同時,其毒性也是VD3的5—10 倍[11],因此生產(chǎn)實踐中要避免過量添加。 然而目前尚無飼料中25-羥基維生素D3的檢測方法標(biāo)準(zhǔn),而飼料生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制和行業(yè)監(jiān)測都迫切需要建立準(zhǔn)確、可靠的飼料中25-羥基維生素D3的檢測方法。 基于此,本研究對飼料中25-羥基維生素D3的檢測方法進行研究,一方面可以滿足目前動物精準(zhǔn)營養(yǎng)研究的需要,另一方面也可為飼料質(zhì)量安全監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的配合飼料和預(yù)混合飼料樣本從上海某飼料廠采集。

1.2 主要儀器與試劑

ACQUITY UPLC,紫外檢測器TUV Detector,Empower 色譜工作站;XSelect HSS T3 色譜柱(5 μm,4.6 mm HSS T3),Talboys 數(shù)顯多管渦旋混合器。

25-羥基維生素D3(C27H46O3,CAS 號63283-36-3,Dr.Ehrenstorfer 公司,純度＞98.1%);甲醇(色譜純)、甲基叔丁基醚(色譜純)、氯化鈉(化學(xué)純)和水(一級水)。

1.3 25-羥基維生素D3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)母液(1 000 mg∕L)的配制

稱取25-羥基維生素D3約10 mg(準(zhǔn)確到0.000 1 g),置于10 mL 棕色容量瓶中,加入5 mL 的甲醇,在超聲波水浴中超聲5 min 助溶,用甲醇定容至刻度,混勻配制為1 000 mg∕L 25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)母液,-18 ℃以下保存,有效期6 個月。

1.3.2 25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 mg∕L)的配制

吸取25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)母液(1.3.1)10 mL 于100 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,混勻配制為25-羥基維生素D3儲備液,-18 ℃以下保存,有效期3 個月。

1.3.3 25-羥基維生素D3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

用甲醇將25-羥基維生素D3儲備液(1.3.2)稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.05 mg∕L、1 mg∕L、2 mg∕L、10 mg∕L 和100 mg∕L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試驗樣品的制備

按GB∕T 14 699.1 規(guī)定,取有代表性的飼料樣品至少500 g,四分法縮減至100 g,磨碎,過0.28 mm 孔徑樣品篩,混勻裝入密閉容器中,避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試驗樣品的前處理

稱取維生素∕復(fù)合預(yù)混合飼料1 g,或配合飼料2 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL 離心管中,加入10 mL蒸餾水,加蓋渦旋混勻后置于Talboys 數(shù)顯多管渦旋混合器上以2 500 r∕min 振搖15 min,取出加入1 g氯化鈉混勻,再準(zhǔn)確加入10.0 mL 甲基叔丁基醚,加蓋渦旋充分混勻提取2 min 后,Talboys 數(shù)顯多管渦旋混合器上以2 500 r∕min 振搖15 min,然后在3 000 r∕min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min。 精密吸取適量上清液(上層有機相)至10 mL 棕色玻璃管中,40 ℃水浴中N2吹干,取出用適量甲醇復(fù)溶,超聲波水浴中超聲2 min 助溶,渦旋混勻,過0.45 μm 有機系微孔濾膜,濾液供高效液相色譜儀分析。

1.6 液相色譜分析條件

流動相為95%甲醇水溶液(體積比95∶5),進樣體積10uL;流速1 mL∕min,柱溫30 ℃,檢測波長265 nm,25-羥基維生素D3保留時間6.047 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

試驗選擇甲基叔丁基醚作為溶劑萃取試劑,與乙醚相比,甲基叔丁基醚的沸點沒有那么低,特別是夏天氣溫較高時的提取操作,不容易像乙醚一樣渦旋時溢出或放置時揮發(fā)而造成損失。

2.2 萃取過程的優(yōu)化

由于預(yù)混合飼料和配合飼料中的組分復(fù)雜,在樣品中加入適量的純凈水,一方面可以去除飼料中的水溶性雜質(zhì),另一方面可以將飼料樣品充分潤濕避免結(jié)塊兒,為后續(xù)溶劑萃取作準(zhǔn)備。

在溶劑萃取前需要加入適量加氯化鈉,這是因為氯化鈉會溶解到水中,使得水溶液的極性更強,從而加大和有機溶劑之間的極性差別,有助于水相和有機相分離,避免乳化。 且采用密度小于水的有機溶劑時,NaCl 溶解到水里之后加大了水相的密度,從而加大水相和有機相的密度差,加快了兩相之間的分層。試驗對比了萃取前加與不加氯化鈉,由圖1 可以看出,加氯化鈉可以提高萃取效率,提高目標(biāo)物的檢測值。

2.3 HPLC 條件的優(yōu)化

2.3.1 流動相的優(yōu)化

試驗比較了不同比例甲醇-水作為流動相對目標(biāo)化合物的分離效果的影響,結(jié)果表明,采用甲醇∶水(V∕V) =95∶5可以更好地分離復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)物(圖2、圖3)。

2.3.2 色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性

采用1.6 的色譜條件,對畜禽預(yù)混合飼料和配合飼料中25-羥基維生素D3的含量進行檢測,結(jié)果表明本試驗所優(yōu)化的色譜條件可廣泛應(yīng)用于各種飼料中25-羥基維生素D3的測定。

2.4 線性范圍及定量限

將25-羥基維生素D3儲備液配置成質(zhì)量濃度分別為0.05 mg∕L、1 mg∕L、2 mg∕L、10 mg∕L 和100 mg∕L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,然后以25-羥基維生素D3峰面積Y對質(zhì)量濃度X(μg∕mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為:Y=2.90 ×104X+1.07 ×104,方程的決定系數(shù)(R2)為0.999 8,表明在0.05—100 μg∕mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 以信噪比(S∕N)≥10 計算,方法的定量限為0.3 mg∕kg。

2.5 加標(biāo)回收率

取豬配合飼料和豬復(fù)合預(yù)混合飼料樣品基質(zhì)2 g,分別添加0.3 mg∕kg、0.6 mg∕kg 和3 mg∕kg 25-羥基維生素D3,進行加標(biāo)回收率試驗,每個添加水平重復(fù)6 次。 結(jié)果表明:25-羥基維生素D3的平均回收率為90%—97%(表1),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%—4%。 證實該方法的準(zhǔn)確度較高,滿足測定要求。

表1 不同飼料樣品中25-羥基維生素D3 的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recovery rates and relative standard deviations of 25-hydroxyvitamin D3 monohydrate in feeds(n=6)

2.6 精密度

取同一復(fù)合預(yù)混合飼料樣品,重復(fù)測定10 次,樣品中25-羥基維生素D3含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%(表2),滿足飼料中營養(yǎng)成分檢測的要求。

表2 復(fù)合預(yù)混合飼料中25-羥基維生素D3 含量的測定Table 2 Determination of 25-hydroxyvitamin D3 monohydrate in compound premix feed

2.7 方法適用性驗證

選取添加了25-羥基維生素D3的飼料產(chǎn)品(蛋雞維生素預(yù)混合飼料、蛋雞復(fù)合預(yù)混合飼料、種畜禽維生素預(yù)混合飼料、種畜禽復(fù)合預(yù)混合飼料雞飼料以及動物保健產(chǎn)品)進行了測定。 結(jié)果表明:應(yīng)用本方法檢測飼料中25-羥基維生素D3的含量其相對偏差均小于5%(表3),符合飼料檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 不同飼料樣品中25-羥基維生素D3 的測定Table 3 Determination of 25-hydroxyvitamin D3 monohydrate in feeds

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明,采用高效液相色譜法分析飼料中25-羥基維生素D3的保留時間重現(xiàn)性好,含量和峰面積比值之間呈良好的線性關(guān)系,加標(biāo)回收率準(zhǔn)確度高,精密度高。 該法測定飼料中的25-羥基維生素D3含量簡便、快速、準(zhǔn)確。