孫欽軍,包建強,2,3*,徐志善,王錫念,馬翼飛

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;2 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海201306;3農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海),上海201306)

甲魚,學(xué)名鱉(Trionyx sinensis),俗稱團魚、腳魚等,隸屬于鱉科(Trionychidae)鱉屬(Trionyx)[1],在中國大部分地區(qū)均有分布。 甲魚具有較高的食藥價值,蛋白質(zhì)含量豐富、酶類生物活性較強,死后極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。

目前,水產(chǎn)品常用保鮮方法有低溫保鮮、真空保鮮、氣調(diào)保鮮、化學(xué)與輻射保鮮等,其中低溫保鮮以良好的保鮮效果受到眾多學(xué)者的關(guān)注[2-3]。 李越華等[4]研究表明,在-3 ℃條件下,鯽魚貨架期較4 ℃延長16 d,微凍貯藏具有更好的保鮮效果,能明顯延長鯽魚貨架期。 王立娜等[5]研究表明, -2 ℃貯藏的鯉魚肉在感官品質(zhì)、色澤與揮發(fā)性成分的變化上優(yōu)于4 ℃冷藏。 Alasalvar 等[6]研究表明,第12 天時,4 ℃冷藏條件下與-3 ℃微凍條件下養(yǎng)殖鯛魚和野生鯛魚的肌苷酸(IMP)含量相比第0 天分別下降98.8%和81.3%,4 ℃冷藏條件下IMP 含量的下降速率顯著大于-3 ℃微凍貯藏的速率。 目前,國內(nèi)外主要對甲魚的生活環(huán)境、營養(yǎng)價值、藥用價值及基因等[7-9]方面進行研究,而對低溫貯藏過程中甲魚品質(zhì)變化的研究未見相關(guān)報道。

本試驗以甲魚作為研究對象,依據(jù)家庭貯藏習慣,選取冷藏室溫度(4 ℃、0 ℃)與微凍室溫度( -3 ℃)為貯藏條件,測定甲魚肌肉菌落總數(shù)、pH、硫代巴比妥酸值(TBARS)、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、ATP 關(guān)聯(lián)產(chǎn)物、K 值和感官品質(zhì)等指標,研究不同貯藏溫度下甲魚肌肉品質(zhì)的變化規(guī)律,以期為甲魚低溫保鮮與加工研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮甲魚購于浙江省寧波市明鳳漁業(yè)有限公司,甲魚質(zhì)量(750 ±50)g∕只,均為同齡甲魚,活體運至實驗室。

DSC-Q2000 型差示掃描量熱儀(美國TA 儀器公司),LRH-100CA 型、DHP-9162 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),H1850R 型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),YXQ-LS-30SH 型全自動壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司),Waters-e2695 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司),S2 型pH 計(梅特勒-托利多儀器有限公司),UV-757 型紫外分光光度計(杭州科曉儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

甲魚宰殺后,無菌水洗凈、瀝干,將處理干凈的甲魚肌肉裝入PE 保鮮袋中,排出空氣,分裝,置于4 ℃、0 ℃、-3 ℃的恒溫恒濕箱內(nèi)貯藏。 4 ℃、0 ℃處理每2 d 測定一次指標,-3 ℃處理每3 d 測定一次指標,各指標均重復(fù)測定3 次。

1.2.2 冰點測定

參考劉大松[10]測定冰點的方法,采用差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry,DSC)測定甲魚冰點。 準確稱取甲魚肌肉5—12 mg,加入已知質(zhì)量的鋁坩堝,選取相同質(zhì)量的鋁坩堝作為空白對照,鋁坩堝壓封,上機測定。 設(shè)置程序:初溫為10 ℃,以50 ℃∕min 降溫至-40 ℃,恒溫5 min,以5 ℃∕min 升溫至5 ℃。 降溫曲線的峰起始溫度為凍結(jié)溫度,升溫曲線的峰值相變溫度為熔融點溫度,即為甲魚冰點溫度[11]。

1.2.3 菌落總數(shù)測定

采用GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法測定甲魚肌肉的菌落數(shù)量。

1.2.4 pH 測定

用剪刀剪碎甲魚肌肉并混合均勻,準確稱取5.00 g 肉樣,加入45 mL 去離子水(煮沸后冷卻至室溫),均質(zhì)后靜置30 min,測定pH 并記錄。

1.2.5 硫代巴比妥酸值(TBARS)測定

參考Siu 等[12]方法測定。

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定

測定方法參照GB∕T 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》。

1.2.7 ATP 關(guān)聯(lián)產(chǎn)物與K 值測定

參照Yokoyama 等[13]的方法測定ATP 關(guān)聯(lián)產(chǎn)物。 精確稱取甲魚肌肉5.000 g,剪碎待用,加入10 mL預(yù)冷的10%高氯酸,均質(zhì)機勻漿后,4 ℃下10 000 r∕min 離心10 min,取上清液,用10 mL 預(yù)冷的5%高氯酸洗滌沉淀,離心,合并上清液。 用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5,轉(zhuǎn)至50 mL 容量瓶定容,搖勻后0.45 μm膜過濾,上機HPLC 分析,外標法定量。

K值是ATP 的分解產(chǎn)物次黃嘌呤核苷(HxR)與次黃嘌呤(Hx)總量占ATP 關(guān)聯(lián)物總量的百分比,通過ATP 關(guān)聯(lián)物含量的變化可計算出K值[14]。K值低于20%被認為是一級鮮度,20%—60%為二級鮮度,60%—80%則處于初期腐敗狀態(tài)[15],K值超過60%就表示該樣品無法食用。

式中:ATP(腺苷三磷酸)、ADP(腺苷二磷酸)、AMP(腺苷酸)、IMP(肌苷酸)、HxR、Hx 均為樣品中的含量,單位為μmol∕g。

1.2.8 感官測定

參考GB∕T 29605—2013《感官分析 食品感官質(zhì)量控制導(dǎo)則》并結(jié)合甲魚實際特點制定感官評價表(表1)。 以表1 中指標為評分標準,由10 名感官評定人員對貯藏期內(nèi)的甲魚肌肉進行評分,感官評定結(jié)果取平均值,平均分16 分以上為一級鮮度,10—16 分為二級鮮度,低于10 分為不可接受。

表1 甲魚肌肉感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of soft-shelled turtle muscle

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS Statistics 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析與差異性顯著分析,P＜0.05 表示具有顯著性差異;利用Origin 9.1 軟件制圖,數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰點測定

圖1 為甲魚肌肉熔融DSC 曲線,熱流為負值,表示處于吸熱過程,溫度在未進入冰溫帶之前,熱流平穩(wěn),所需能量未出現(xiàn)顯著變化;甲魚肌肉進入冰溫帶,熱流變化顯著,所需能量增加,在-1.43 ℃達到最大值,因此判定甲魚冰點溫度為-1.43 ℃。 根據(jù)微凍定義,微凍貯藏溫度一般低于冰點溫度1—2 ℃,結(jié)合家庭冰箱微凍室溫度,選取-3 ℃為甲魚微凍貯藏溫度。

2.2 不同貯藏溫度下甲魚肌肉菌落總數(shù)的變化

如圖2 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉菌落總數(shù)均不斷增加,4 ℃貯藏甲魚肌肉菌落總數(shù)增長速率顯著高于0 ℃和-3 ℃貯藏,貯藏8 d 后菌落總數(shù)顯著超出限量標準[6.0lg(CFU∕g)][16]。 0 ℃和-3 ℃條件下甲魚肌肉菌落總數(shù)分別在貯藏前6 d、15 d 增長相對緩慢,隨后菌落總數(shù)增長速度加快,并分別于15 d、27 d 超出限量標準。 如以菌落總數(shù)為參考依據(jù),4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉貨架期分別為6 d、13 d 和26 d,-3 ℃貯藏時間較4 ℃和0 ℃貯藏分別延長了7 d、13 d,-3 ℃貯藏可以有效降低甲魚肌肉微生物生長繁殖的速度,延緩甲魚肌肉品質(zhì)劣變。

2.3 不同貯藏溫度下甲魚肌肉pH 的變化

如圖3 所示,貯藏期間甲魚肌肉pH 呈先降后升的“V”型趨勢,不同貯藏溫度下甲魚肌肉pH 變化均在6.79—7.00,4 ℃、0 ℃和-3 ℃條件下甲魚肌肉分別在2 d、4 d、9 d 降至最小值,隨后呈上升趨勢。4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉pH 分別于8 d、14 d 和27 d 升至7.01、6.97、6.98,-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉pH 增加速度顯著低于4 ℃和0 ℃貯藏。

2.4 不同貯藏溫度下甲魚肌肉TBARS 值的變化

如圖4 所示,新鮮甲魚TBARS 值為0.145 mg MDA∕kg,隨著貯藏時間的延長,不同貯藏溫度下甲魚肌肉TBARS 值均呈上升趨勢,4 ℃貯藏甲魚肌肉脂肪氧化酸敗變化速度顯著高于0 ℃與-3 ℃貯藏。4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下TBARS 值在8 d、14 d、27 d 分別升至0.512 mg MDA∕kg、0.468 mg MDA∕kg、0.496 mg MDA∕kg,-3 ℃貯藏在延緩甲魚肌肉脂肪氧化酸敗方面具有明顯的優(yōu)勢。

2.5 不同貯藏溫度下甲魚肌肉TVB-N 值的變化

依據(jù)國標GB 2733—2015《食品安全國家標 準鮮、凍動物性水產(chǎn)品》規(guī)定,淡水魚蝦類揮發(fā)性鹽基氮含量不得超過國家二級鮮度標準[20 mg∕(100 g)]。 如圖5 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉揮發(fā)性鹽基氮含量均呈不斷上升的變化趨勢,4 ℃、0 ℃條件下甲魚肌肉TVB-N 值增加速度顯著高于-3 ℃貯藏,4 ℃、0 ℃分別貯藏8 d、16 d 超出國家二級鮮度標準,-3 ℃貯藏27 d 才超出國家二級鮮度標準,-3 ℃貯藏減緩了低級胺類化合物生成速度,延長了甲魚肌肉貯藏時間。 如以TVB-N 值為依據(jù),4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉的貨架期分別為6 d、15 d、26 d。

2.6 不同貯藏溫度下甲魚肌肉ATP 關(guān)聯(lián)產(chǎn)物與K 值的變化

由圖6A 可知,不同貯藏溫度下甲魚肌肉ATP 值均呈下降趨勢(P＜0.05),貯藏前期,4 ℃、0 ℃、-3 ℃處理甲魚肌肉ATP 含量分別在2 d、4 d 、6 d 下降超過90%,之后各處理ATP 含量均處于較低水平且趨于穩(wěn)定。

如圖6B 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉IMP 含量均呈現(xiàn)先上升后下降變化趨勢,4 ℃和0 ℃在貯藏2 d 時達到峰值(1.18 μmol∕g 、1.88 μmol∕g),-3 ℃處理在第3 天達到峰值(2.09 μmol∕g),隨后IMP 含量均呈下降趨勢。 貯藏結(jié)束時,IMP 含量分別為0.018 μmol∕g(4 ℃,8 d)、0.027 μmol∕g(0 ℃,14 d)、0.013 μmol∕g( -3 ℃,27 d)。 與4 ℃和0 ℃貯藏相比, -3 ℃貯藏能有效降低甲魚肌肉IMP 分解速率,延長肌肉鮮味保持時間。

甲魚肌肉HxR 含量整體呈先上升后下降變化趨勢(圖6C),4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏溫度下分別于4 d、6 d 與12 d 升至最大值,之后HxR 含量分別于8 d、14 d、27 d 降至0.375 μmol∕g、0.243 μmol∕g 和0.225 μmol∕g。

如圖6D 所示,4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉Hx 含量均隨時間延長不斷增加,貯藏末期Hx 含量分別增至0.435 μmol∕g(8 d)、0.432 μmol∕g(14 d)、0.441 μmol∕g(27 d)。 隨著Hx 含量不斷增加,甲魚肌肉也逐漸趨于腐敗。

由圖7 可以看出,不同貯藏條件下甲魚肌肉K 值均呈上升趨勢,0 ℃和-3 ℃貯藏條件下K 值變化速度顯著低于4 ℃貯藏。 4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉K 值分別于3 d、5 d、9 d 超過國家一級鮮度標準,于8 d、14 d和27 d 超過國家二級鮮度標準。 以K 值為依據(jù),4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉貨架期分別為7 d、13 d、26 d。

2.7 不同貯藏溫度下甲魚肌肉感官品質(zhì)的變化

如圖8 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉感官品質(zhì)均隨貯藏時間的延長而下降,溫度越低,下降速度越慢。 貯藏過程中4 ℃、0 ℃、-3 ℃處理甲魚肌肉分別在3 d、5 d、9 d 進入國家二級鮮度范圍,此結(jié)果與K值測定結(jié)果一致,之后3 組分別于8 d、14 d、27 d 超出可接受范圍,甲魚肉色澤暗淡,原有氣味消失,粘液較多。 通過感官品質(zhì)評定發(fā)現(xiàn),-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉在感官品質(zhì)方面具有明顯的優(yōu)勢,甲魚感官品質(zhì)變化速度相對較慢。 以感官品質(zhì)為依據(jù),4 ℃、0 ℃、 -3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉貨架期分別為7 d、13 d、25 d。

3 討論與結(jié)論

甲魚肌肉腐敗變質(zhì)原因主要有兩個:一是外界微生物的污染,二是肌肉自身酶的活動[17]。 微生物生長繁殖與酶的活性均受溫度的影響。 4 ℃不足以抑制微生物與酶的活性,甲魚肌肉蛋白質(zhì)在水解酶的作用下分解為氨基酸及揮發(fā)性氨、三甲胺和二甲胺等低級胺類化合物[18],促使TVB-N 含量顯著上升,同時細菌利用氨基酸等大量繁殖并產(chǎn)生氨、吲哚、硫化氫、組胺等有腐臭味的物質(zhì)[19],造成甲魚肌肉鮮度下降。0 ℃和-3 ℃處于甲魚肌肉冰溫帶,大部分微生物與酶的活性被抑制,同時細菌體液中水分部分凍結(jié),體積增大產(chǎn)生擠壓,使菌體破裂死亡[20],其菌落總數(shù)分別在6 d、15 d 前增長緩慢,隨著貯藏時間的延長,肌肉體表與體內(nèi)的微生物逐漸適應(yīng)環(huán)境大量繁殖,TVB-N 含量增加,甲魚肌肉鮮度下降,品質(zhì)劣變速度增快。 對菌落總數(shù)與TVB-N 值、K 值進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),4 ℃、0 ℃、 -3 ℃條件下甲魚肌肉菌落總數(shù)與TVB-N 值相關(guān)系數(shù)為0.997、0.944、0.944,與K 值相關(guān)系數(shù)為0.989、0.959、0.891,表明TVB-N 值、K 值變化與菌落總數(shù)變化具有高度一致性,微生物是影響甲魚肌肉品質(zhì)劣變的重要因素。

貯藏過程中脂質(zhì)氧化會導(dǎo)致風味劣變、營養(yǎng)損失,甚至會產(chǎn)生毒素,嚴重影響甲魚肌肉品質(zhì)[21]。 本試驗發(fā)現(xiàn),低溫有效延緩了不飽和脂肪酸氧化酸敗,-3 ℃貯藏TBARS 值增長速度顯著低于4 ℃和0 ℃貯藏。 TBARS 值以丙二醛(MDA)含量反映脂肪氧化酸敗程度,當TBARS 值超過1.0—2.0 mg MDA∕kg 時肌肉會產(chǎn)生不良氣味[22],4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下貯藏8 d、14 d、27 d 甲魚肌肉已無法食用,但其TBARS 值仍未超過閾值,其原因可能是MDA 與胺類、核酸、蛋白質(zhì)、磷脂氨基酸以及脂肪氧化的終產(chǎn)物醛類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[22],因此在判斷甲魚肌肉貨架期時,TBARS 值不宜單獨作為參考指標。

甲魚宰殺后肌細胞中肌漿網(wǎng)的鈣離子吸附能力下降,大量鈣離子進入細胞液中,細胞液中鈣離子濃度升高激活了肌原纖維ATP 酶的活性,ATP 被快速降解[23],同時肌肉也因ATP 分解產(chǎn)生的磷酸和無氧條件下糖原酵解產(chǎn)生的乳酸導(dǎo)致pH 下降,隨著貯藏時間延長,甲魚肌肉糖原酵解逐漸停止,ATP 降至較低水平,pH 出現(xiàn)最小值,隨后微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的堿性物質(zhì)逐漸增多,肌肉pH 逐漸升高。 4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉IMP 含量貯藏期間均出現(xiàn)蓄積過程,之后在磷酸單酯酶和核苷水解酶作用下進一步分解產(chǎn)生HxR 和Hx[24],貯藏6 d, -3 ℃條件下IMP 含量為1.718 μmol∕g,4 ℃和0 ℃僅分別為0.762 μmol∕g 、0.257 μmol∕g,溫度越低,IMP 分解速度越慢。 IMP 作為ATP 降解的中間產(chǎn)物,是鮮味的主要來源[25],降低溫度有利于維持甲魚肌肉鮮味,保持肌肉品質(zhì)。 不同貯藏溫度下甲魚肌肉HxR 含量呈先升后降的變化趨勢,貯藏前期HxR 生成速度顯著大于降解速度,隨著貯藏時間延長,核苷磷酸化酶降解HxR 速度逐漸增快,大量HxR 脫去1-磷酸核糖生成Hx[26],Hx 作為肉中苦味物質(zhì)不斷積累造成甲魚肌肉新鮮度下降[27]。

水產(chǎn)品理化性質(zhì)、微生物相關(guān)指標通常會與感官評價相結(jié)合[28]。 本試驗中,4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉感官評價分別于8 d、14 d、27 d 超出可接受范圍,這與菌落總數(shù)、TVB-N 值和K 值所得結(jié)論相吻合。

本試驗通過研究不同貯藏溫度下甲魚肌肉品質(zhì)和ATP 關(guān)聯(lián)產(chǎn)物變化發(fā)現(xiàn),降低溫度有助于延緩甲魚肌肉品質(zhì)劣變,延長甲魚貯藏時間。 綜合研究得知,家庭選取微凍貯藏(-3 ℃)更有利于維持甲魚肌肉鮮度,保持甲魚品質(zhì),4 ℃、0 ℃、-3 ℃貯藏貨架期分別為6 d、13 d、25 d。