楊新，陳莉，楊雙全，盧紅梅，章之柱，楊華連，孟洋，魏建敏

1(貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng),550025)2(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng),550025) 3(貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng),550025)4(開(kāi)陽(yáng)縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局，貴州 貴陽(yáng),550300)

硒(selenium，Se)是一種人體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，具有“生命火種”、“心臟的守護(hù)神”和“抗癌之王”的美譽(yù)[1-2]。硒作為體內(nèi)某些酶和蛋白的重要組成部分，具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、影響人和動(dòng)物的生殖發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、拮抗有害重金屬和預(yù)防多種疾病等生物學(xué)功能[3-6]。硒元素的缺乏會(huì)引起心血管疾病、腫瘤、克山病、大骨節(jié)病、癌癥、高血壓和免疫系統(tǒng)功能紊亂等疾病[7-10]。由于硒元素在人體中無(wú)法合成，因此需要從日常飲食中攝取，人體內(nèi)硒水平的高低主要取決于膳食結(jié)構(gòu)、食物中硒的含量及其化學(xué)形態(tài)[11]。然而，硒在地殼中的分布極不均勻，很多國(guó)家和地區(qū)都處于缺硒狀態(tài)。我國(guó)是一個(gè)缺硒較為嚴(yán)重的國(guó)家，國(guó)土面積72%地區(qū)的土壤硒元素缺乏(<0.6 mg/kg)，開(kāi)陽(yáng)縣土壤硒含量為0.12～2.43 mg/kg，均值為0.61 mg/kg，屬于我國(guó)少有的富硒地之一[12]。從硒攝入量來(lái)看，我國(guó)大部分人群平均每天硒攝入量為26～32 μg，明顯低于世界衛(wèi)生組織制定的硒參考平均每天攝入量為40～200 μg[13-14]。從硒適量到硒中毒這個(gè)范圍是比較狹窄的，成年人每日硒平均攝入量<40 μg或>400 μg均會(huì)對(duì)人體健康造成威脅[14]，因此在適宜的范圍內(nèi)，尋找安全性較高、無(wú)毒副作用的富硒產(chǎn)品，來(lái)滿(mǎn)足人體對(duì)硒元素的需求已成為一種必然趨勢(shì)。

隨著我國(guó)食品工業(yè)的飛速發(fā)展，功能化和營(yíng)養(yǎng)化時(shí)代已到來(lái)，富硒產(chǎn)業(yè)正在蓬勃發(fā)展，富硒產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)方興未艾。富硒酵母被認(rèn)為是一種比無(wú)機(jī)硒更安全、更有效的硒源，常被用來(lái)作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[15]。目前發(fā)現(xiàn)的天然富硒酵母有紅酵母、黏紅酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母等，因天然的富硒酵母富硒量不高，研究人員通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)工藝等多種方法來(lái)提高酵母菌的富硒量[16]。PONCE等[17]在釀酒酵母的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期分別添加不同量的硒鹽，其富硒量提高了20%～30%；YIN等[18]對(duì)培養(yǎng)基pH值、溶氧量等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終釀酒酵母的富硒量達(dá)到了639 μg/g；ZHANG等[19]研究表明,酵母菌在酸的脅迫下有利于促進(jìn)其對(duì)亞硒酸鈉的同化和生物轉(zhuǎn)化，從而使得硒在胞內(nèi)富集；PANKIEWICZ等[20]研究表明,采用脈沖電場(chǎng)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行處理，提高了酵母的耐受性或改變了酶活性，使得細(xì)胞內(nèi)的硒富集量增加了65%。盡管如此，但當(dāng)前各種酵母菌仍然存在富硒能力不穩(wěn)定和富硒能力較低等缺陷，與工業(yè)化生產(chǎn)要求具有一定差距，這成為酵母富硒生產(chǎn)中的一個(gè)瓶頸。此外，一個(gè)酵母細(xì)胞中富集的最大硒量理論上大約為6 000 mg/kg，它與酵母細(xì)胞中的甲硫氨酸和半胱氨酸(殘基)的含量有關(guān)[21]，因此，要想得到高富硒酵母菌，進(jìn)一步從富硒地篩選出能夠在胞內(nèi)積累大量硒蛋氨酸的酵母菌是很有必要的。

為了獲得富硒量較高的酵母菌，本研究以開(kāi)陽(yáng)地區(qū)的富硒桑葚果園為分離源，通過(guò)分離篩選及酵母菌對(duì)硒的耐受性和富集能力的比較，篩選出富硒能力強(qiáng)的酵母菌，然后采用分子生物學(xué)研究方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，從而為富硒酵母菌在食品領(lǐng)域的研究開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

分離樣品采于開(kāi)陽(yáng)縣某桑葚基地，隨機(jī)選取1畝地的4個(gè)角及中心點(diǎn)5棵桑葚樹(shù)，分別在每棵樹(shù)的上中下處隨機(jī)摘取適量桑葚果、桑葚葉，并于根部取適量的土壤，分別裝于無(wú)菌密封袋，混勻，帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑

葡萄糖(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉、蛋白胨，上海博微生物科技有限公司；瓊脂、乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid-2Na,EDTA-2Na)，北京索萊寶科技有限公司；NaCl(分析純)，成都臨江化工廠(chǎng)；氯霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；HCl、HNO3、甲苯(分析純)，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；HClO4(分析純)，成都金山化學(xué)試劑有限公司；3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)，上海源葉生物科技有限公司；亞硒酸鈉(Na2SeO3)(分析純)，山東西亞化學(xué)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、氯霉素0.10(滅菌之后添加)，pH自然。

分離純化培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉10.0、葡萄糖20.0、蛋白胨20.0、瓊脂20.0、氯霉素0.1(滅菌之后添加)，pH自然。

富硒培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉10.0、葡萄糖20.0、蛋白胨20.0、瓊脂20.0(固體加，液體不需要添加)，pH自然，在無(wú)菌操作臺(tái)中吸取1 000 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同硒濃度的富硒培養(yǎng)基。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50.0、酵母膏4.0、蛋白胨5.0、KH2PO40.55、KCl 0.425、 MgSO40.125、CaCl20.125、MnSO40.0025、FeCl30.002 5、溴甲酚綠0.022、瓊脂20.0、氯霉素0.10，調(diào)pH值至6.5。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌20 min，備用。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SN-CJ-IF潔凈工作臺(tái)、YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽殺菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱、DHG—9140B(101-2B)智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BCD-290 W冰箱，青島海爾股份有限公司；SZ-96A自動(dòng)純水蒸餾器，上海嘉措儀器設(shè)備有限公司；ZD-2A自動(dòng)電位滴定儀，上海大普儀器有限公司；DMS-653廣西生物數(shù)碼顯微鏡，深圳市博宇儀器有限公司；∑IGMA電子掃描顯微鏡，北京普瑞賽司儀器有限公司；722S可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；2720 thermal cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、3730XL測(cè)序儀，Applied Biosystems；JY300C電泳儀、JYDF電泳槽、JY04S-3C凝膠成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；VaCo 5-II-D真空冷凍干燥機(jī)，Zirbus technology GmbH Hilfe Gottes。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑果中酵母菌的分離

取10粒成熟的桑果、5片葉子、1 g土壤分別加入滅過(guò)菌的裝有100 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后將錐形瓶放在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。在無(wú)菌條件下分別取上述富集過(guò)后的母液1 mL，采用無(wú)菌生理鹽水按10倍梯度稀釋法稀釋至10-6。選擇10-3～10-6稀釋梯度的樣品勻液，每個(gè)稀釋梯度吸取200 μL均勻涂布于滅過(guò)菌的酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，觀察并記錄菌落特征。分別挑選不同形態(tài)的單菌落，通過(guò)劃線(xiàn)稀釋法在YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，重復(fù)3～4次純化操作，得到純的酵母菌。

1.2.2 富硒酵母菌種子液的制備

用接種環(huán)挑取1環(huán)活化好的酵母菌接種到含有100/250 mL YPD種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 h后，得到種子液。

1.2.3 富硒酵母菌的篩選

1.2.3.1 富硒酵母菌的初篩

首先將分離純化后得到的酵母菌接種到含有20.00 μg/mL硒(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)將亞硒酸鈉折算成硒，后文相同)的YPD培養(yǎng)基上，然后通過(guò)觀察酵母菌的長(zhǎng)勢(shì)及顏色，選出長(zhǎng)勢(shì)較好且顏色微紅或未變紅[22]的酵母菌做液體培養(yǎng)試驗(yàn)。

將上述篩選的酵母菌以5%的接種量分別接種于含有硒質(zhì)量濃度為0.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/mL的YPD液體培養(yǎng)基的試管中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～60 h，通過(guò)觀察試管底部菌體沉淀量及其顏色變化，然后經(jīng)過(guò)對(duì)比篩選出富硒能力較強(qiáng)的酵母菌。

1.2.3.2 富硒酵母菌的復(fù)篩

將初篩得到的富硒酵母菌以5%的接種量分別接種于含有100/250 mL硒質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL的YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，測(cè)其生物量及富硒量，然后計(jì)算其硒轉(zhuǎn)化率，篩選獲得硒轉(zhuǎn)化率較高的酵母菌。

1.2.4 富硒酵母菌的初步鑒定

1.2.4.1 富硒酵母菌的個(gè)體形態(tài)特征

本研究觀察菌體個(gè)體形態(tài)特征采用光學(xué)顯微鏡及電子掃描顯微鏡。光學(xué)顯微鏡通過(guò)載玻片法：用接種環(huán)挑取少許生長(zhǎng)于培養(yǎng)基上的菌進(jìn)行制片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照[23]；電鏡掃描：首先在樣品臺(tái)上粘上導(dǎo)電雙面膠，然后蘸少許樣品于導(dǎo)電雙面膠上，使用洗耳球?qū)](méi)有固定牢固的樣品吹掉。由于菌體的導(dǎo)電性能比較差，因此，在固定好的樣品上噴金來(lái)提高其導(dǎo)電性，使得成像清晰，最后上機(jī)觀察并拍照[24]。

1.2.4.2 富硒酵母菌的培養(yǎng)特征

固體培養(yǎng)特征：采用劃線(xiàn)法將活化好的菌種接種于含有YPD固體培養(yǎng)基的平板上，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，最后觀察菌株的生長(zhǎng)狀況并進(jìn)行記錄，主要從菌落表面特征、菌落顏色及菌落邊緣形狀等特征入手。

液體培養(yǎng)特征：將活化好的種子液按5%的接種量接種于含有100/250mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄試驗(yàn)現(xiàn)象。液體培養(yǎng)特征：培養(yǎng)基表面是否出現(xiàn)菌膜或菌璞，底部有無(wú)沉淀，培養(yǎng)基是否渾濁等。

1.2.4.3 WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基鑒定

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)于大多數(shù)典型的酵母菌可以進(jìn)行區(qū)分，利用它可以對(duì)酵母菌進(jìn)行初步鑒定。將保藏的菌株活化3代后，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)接種，于28 ℃下培養(yǎng)5 d后，觀察并記錄菌落的顏色及形態(tài)，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)對(duì)酵母菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

1.2.5.1 DNA的提取

按照DP336試劑盒說(shuō)明書(shū)提取。

1.1.5.2 PCR擴(kuò)增

以提取的酵母菌的DNA作為模板，26S rDNA序列擴(kuò)增采用的正向擴(kuò)增引物為NL1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)；反向擴(kuò)增引物為NL4(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)。反應(yīng)體系(50 μL)為2×Es Taq Master Mix 25 μL，RNase-Free Water 22 μL，F(xiàn)orward Primer(20 μmol/L)1.0 μL，Reverse Primer(20 μmol/L)1.0 μL，Template DNA 1 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，DL2000 DNA Marker作為參照標(biāo)準(zhǔn)，凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5.3 菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析

將大小合適及條帶清晰的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，將所得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST與己知序列進(jìn)行同源性比較分析，然后利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6 硒含量的測(cè)定[25]

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

吸取10 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL分別移到100 mL的燒杯中，加蒸餾水至35.00 mL，然后加入1.00 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的EDTA-2Na溶液，搖勻，并用HCl(體積比為1∶1)調(diào)節(jié)pH值至2.5左右，再加4.00 mL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))的DBA溶液，振蕩搖勻，置于黑暗處?kù)o置30 min。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH溶液調(diào)pH值至6.5～7.0，倒入到分液漏斗中，加10.00 mL的甲苯用力振蕩2 min，使甲苯充分萃取無(wú)機(jī)硒，靜置分層，棄水層，甲苯層過(guò)濾，收集濾液，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定甲苯層在420 nm處的吸光值，每組做3次平行，并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，取平均值，以橫坐標(biāo)為濃度，縱坐標(biāo)為吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.6.2 酵母硒的測(cè)定

消化：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g酵母粉置于燒杯中，并放入幾粒沸石，加入5.00 mL混合消化液[V(濃HNO3)∶V(HClO4)=4∶1])，先放置一晚上進(jìn)行冷消化處理，次日在電熱爐上進(jìn)行加熱消化，在加熱過(guò)程中，剛開(kāi)始消化瓶?jī)?nèi)冒大量的白煙，溶液由深棕色變?yōu)榈S色，繼續(xù)加熱，待淡黃色煙霧散盡后，溶液變?yōu)闊o(wú)色，繼續(xù)冒白煙，待溶液只剩下1 mL左右接近蒸干時(shí)，可以看見(jiàn)有類(lèi)似于白色晶體的物質(zhì)析出，此時(shí)取下消化瓶，視為消化完全，等消化瓶自然冷卻后，定容至50 mL。為了減少酸中一些微量雜質(zhì)對(duì)結(jié)果的干擾，同時(shí)做空白對(duì)照。

測(cè)定：取10.00 mL樣液，放入100 mL燒杯中，加水至35 mL，后續(xù)步驟同標(biāo)曲的繪制。根據(jù)樣品測(cè)得的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查找相對(duì)應(yīng)的無(wú)機(jī)硒含量，每組重復(fù)3次，取平均值，此為酵母硒。其中總硒含量為培養(yǎng)基中所添加的量，硒轉(zhuǎn)化率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

(2)

式中：QR,酵母硒的富硒量，μg/g；A,吸光度；a,硒標(biāo)曲的斜率；b,硒標(biāo)曲的截距；V0,酵母粉消化后定容的體積，mL；V1,測(cè)定時(shí)吸取樣液的體積，mL；10,將0.100 0 g算換成1 g；η,硒的轉(zhuǎn)化率；m,酵母菌的生物量，g；Q0,發(fā)酵液硒的初始質(zhì)量，μg。

1.2.7 酵母菌的生物量測(cè)定

菌體生物量的測(cè)定采用干重法。具體方法為取清洗干凈的50 mL離心管6個(gè)，然后吸取混勻的酵母菌液50 mL，分別加入離心管內(nèi)，并利用以8 000 r/min離心10 min，舍棄上層清液，用蒸餾水洗滌沉淀并合并，再次離心，舍棄上層清液，重復(fù)洗滌3次，然后放入-80 ℃的冰箱預(yù)凍24 h，再用真空冷凍干燥機(jī)凍干，將凍干得到的菌粉用分析天平稱(chēng)量，即為酵母菌的生物量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次測(cè)定，數(shù)據(jù)均采用平均值的形式表示，圖的繪制采用Origin 8.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒酵母菌的初篩

通過(guò)涂布法，結(jié)合菌落特征，采用劃線(xiàn)方法，共分離純化得到75株酵母菌。將分離純化得到的75株酵母菌，通過(guò)劃線(xiàn)法接種到含有20.0 μg/mL硒的YPD培養(yǎng)基上，根據(jù)酵母菌的長(zhǎng)勢(shì)及顏色，共選出12株長(zhǎng)勢(shì)較好且顏色粉紅或未變紅的酵母菌，分別命名為ST1、ST2、SG1、SG2、SG3、SG4、SG5、SG6、SG7、SG8、SY1、SY2。

將12株酵母菌分別以5%的接種量接種到含不同硒質(zhì)量濃度(0.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/mL)的YPD培養(yǎng)基的試管中，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，比較同一菌株在含有不同硒濃度YPD培養(yǎng)基的試管中底部的菌體沉淀量及顏色的變化，結(jié)果如表1、表2所示。

表1 不同酵母菌在富硒培養(yǎng)液中的菌體沉淀量Table 1 The amount of yeasts precipitated by different yeasts in selenium-rich medium

表2 不同酵母菌在富硒培養(yǎng)液中的顏色比較Table 2 Color comparison of different yeasts in selenium-rich medium

目前，對(duì)富硒微生物篩選的常用方法可分為耐硒法和紅硒法2大類(lèi)，耐硒法是基于微生物對(duì)無(wú)機(jī)硒的抗性與其對(duì)無(wú)機(jī)硒的生物轉(zhuǎn)化能力呈正相關(guān)，紅硒法是基于微生物對(duì)硒的生物轉(zhuǎn)化能力與紅硒的形成呈負(fù)相關(guān)[26-27]，該方法常用于富硒微生物的篩選。由表1可知，隨著硒濃度的增加，各酵母菌培養(yǎng)液菌體的沉淀量逐漸減少，當(dāng)硒質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL時(shí)，菌株ST1、SG1、SG2、SG3、SG7、SG8和SY2的培養(yǎng)液菌體沉淀量變化相對(duì)較小，表明菌株ST1、SG1、SG2、SG3、SG7、SG8和SY2對(duì)無(wú)機(jī)硒亞硒酸鈉的耐受性較強(qiáng)。由表2可知，隨著硒濃度的增加，各酵母菌培養(yǎng)液菌體的顏色逐漸加深，當(dāng)硒質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL時(shí)，菌株ST1、SG1、SG3、SG5、SG6、SG7、SG8和SY2的菌體為粉紅色，而其他菌株菌體的顏色為紅色，表明菌株ST1、SG1、SG3、SG5、SG6、SG7、SG8和SY2對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)。結(jié)合耐硒法和紅硒法，最終選擇ST1、SG1、SG3、SG7、SG8和SY2作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

2.2 富硒酵母菌的復(fù)篩

2.2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

2.2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將配制的硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在300～800 nm內(nèi)采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示，在420 nm處有最大吸收值，故選用420 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 硒與3,3′-二氨基聯(lián)苯胺絡(luò)合物的紫外可見(jiàn)光譜圖Fig.1 Uv-visible spectrogram of selenium complex with 3,3′-diaminobenzidine

2.2.1.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將配制的硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)其420 nm處的吸光值，然后以吸光值為縱坐標(biāo)，硒濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)。其回歸方程為y=0.004 61x-0.005 82，R2=0.999 23，表明硒質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL線(xiàn)性良好。

圖2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Selenium standard curve

2.2.2 酵母菌富硒能力比較

將初篩得到的酵母菌分別以5%的接種量接種到含有20.00 μg/mL硒的培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床(28 ℃)培養(yǎng)48 h后測(cè)其生物量、富硒量和硒的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖3所示。在20.00 μg/mL硒質(zhì)量濃度酵母菌對(duì)硒的富集能力不一樣，其中酵母菌ST1、SG1、SG3、SG7、SG8、SY2的硒含量分別為1 998.62、1 969.04、1 857.30、1 965.09、1 717.42、2 278.35 μg/g，生物量分別為3.88、4.07、4.07、3.88、4.28、4.31 g/L，硒轉(zhuǎn)化率分別為38.76%、40.02%、37.82%、38.08%、36.72%、49.11%。從而得出酵母菌SY2對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率最高，因此,選用SY2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 酵母菌SY2對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率Fig.3 The conversion rate of yeast SY2 to sodium selenite

2.3 富硒酵母菌的初步鑒定

2.3.1 富硒酵母菌的個(gè)體形態(tài)特征

將活化好的種子液按5%的接種量接種于含有100/250 mL不同硒濃度的YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。然后制作載玻片，進(jìn)行顯微鏡觀察，同時(shí)進(jìn)行電鏡掃描，結(jié)果如圖4所示，酵母菌呈橢球形，出芽生殖，隨著硒濃度的增加，細(xì)胞大小和形態(tài)受到一定的抑制。當(dāng)硒質(zhì)量濃度為0.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞平均大小為3.56×4.3 μm，硒質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞平均大小為3.36×4.13 μm，硒質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞平均大小為3.22×3.95 μm，硒質(zhì)量濃度為40.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞平均大小為3.08×3.78 μm。當(dāng)硒質(zhì)量濃度為40.00 μg/mL 時(shí)，部分細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生形變。

a-0.00 μg/mL;b-10.00 μg/mL;c-20.00 μg/mL;d-40.00 μg/mL圖4 酵母菌SY2的個(gè)體形態(tài)特征Fig.4 Individual morphological characteristics of yeast SY2

2.3.2 富硒酵母菌的培養(yǎng)特征

將活化好的菌種劃線(xiàn)接種于不同硒濃度的YPD固體培養(yǎng)基上，同時(shí)將活化好的種子液按5%的接種量接種于含有100/250 mL不同硒濃度的YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，結(jié)果如圖5所示，酵母菌株SY2菌落表面光滑、反光，奶酪狀，乳白色，邊緣平滑。液體培養(yǎng)基表面無(wú)菌膜或菌璞，底部有沉淀，培養(yǎng)基渾濁。隨著硒濃度的增加，菌落逐漸變小，顏色越來(lái)越深。同樣，液體培養(yǎng)過(guò)程中，隨著硒濃度的增加，培養(yǎng)液的顏色越來(lái)越紅。

a-0.00 μg/mL；b-10.00 μg/mL；c-20.00 μg/mL；d-40.00 μg/mL圖5 酵母菌SY2的培養(yǎng)特征Fig.5 Culture characteristics of yeast SY2

2.3.3 富硒酵母菌的培養(yǎng)特征

將酵母菌株SY2接種到WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，其菌落形態(tài)如圖6所示，菌落顏色為奶油色帶綠色，球形凸起，表面光滑，不透明，奶油狀，根據(jù)相應(yīng)酵母菌在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征，初步鑒定其為釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。

圖6 酵母菌SY2在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.6 Colony morphology of yeast SY2 on WL nutrient agar medium

2.4 富硒酵母菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

利用NL1和NL4一對(duì)引物擴(kuò)增酵母菌SY2的26S rDNA近5′端的D1/D2區(qū)域，產(chǎn)物在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠,PCR電泳圖譜如圖7所示，得到約600 bp的片段，清晰可見(jiàn)，無(wú)雜帶，可用于26S rDNA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST中，與己知序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果如表3所示，然后利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖8)。

M-DL2000 Marker圖7 富硒酵母菌SY2 26S rDNA序列PCR擴(kuò)增電泳Fig.7 Electropherogram of PCR amplification products of 26S rDNA sequence from selenium-enriched yeast SY2

由表3可知，篩選得到的酵母菌株SY2與釀酒酵母菌(S.cerevisiae)的相似度為100%，即可鑒定其為釀酒酵母菌(S.cerevisiae)，這與WL培養(yǎng)基初步鑒定結(jié)果一致，也進(jìn)一步說(shuō)明WL培養(yǎng)基初步鑒定結(jié)果較為準(zhǔn)確。由圖8可知，釀酒酵母菌SY2與菌株S.cerevisiae(JN867135.1)及S.cerevisiae(LC334458.1)聚在一起。

表3 酵母菌SY2與相關(guān)菌株的相似性Table 3 Similarities between yeast SY2 and related strains

圖8 富硒酵母菌株SY2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 The phylogenetic tree of Selenium-enriched yeast SY2

3 結(jié)論

本研究從開(kāi)陽(yáng)地區(qū)的富硒桑葚果園中分離純化得到75株酵母菌，采用平板劃線(xiàn)及液體培養(yǎng)，根據(jù)耐硒法和紅硒法進(jìn)行初篩，得到6株富硒能力較好的酵母菌，然后通過(guò)硒轉(zhuǎn)化率進(jìn)行復(fù)篩，得到1株硒轉(zhuǎn)化率較高的酵母菌，編號(hào)為SY2，其富硒量為2 278.35 μg/g，生物量為4.31 g/L，硒轉(zhuǎn)化率為49.11%，最后通過(guò)形態(tài)觀察、WL培養(yǎng)基鑒別及26S rDNA測(cè)序分析，鑒定菌株SY2為釀酒酵母菌(S.cerevisiae)。

關(guān)于酵母菌的富硒研究，此前已有較多報(bào)道，比如陳妍等[28]研究表明，啤酒酵母(釀酒酵母)(S.cerevisiae)對(duì)硒的富集能力為932 μg/g，生物量為8.59 g/L；鄒艷等[29]研究表明，產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)對(duì)硒的富集能力為1 575 μg/g，生物量為5.86 g/L；蔡飛等[30]研究表明，庫(kù)德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)對(duì)硒的富集能力為862 μg/g，生物量為9.63 g/L。本研究篩選得到釀酒酵母菌(S.cerevisiae)具有較高的富硒量及轉(zhuǎn)化率。后續(xù)可將該富硒酵母菌應(yīng)用于桑葚果酒及其他產(chǎn)品的生產(chǎn)，這對(duì)于促進(jìn)桑葚資源的綜合利用，豐富富硒產(chǎn)品的多元化開(kāi)發(fā)，推動(dòng)開(kāi)陽(yáng)縣富硒產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展都將具有積極意義。