葉興濤 史國軍 陸 寧 董 晶 施 航 徐央波

（寧波市中醫(yī)院腫瘤科，寧波 315010）

全球每年因肝癌死亡的患者超過100萬人，全球病患總數(shù)中國人占43.7%，病死率近50%，治療后5年生存率約50%，多數(shù)患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-2]。近些年來，作為重要的細(xì)胞間黏附分子和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵遞質(zhì)，β-catenin在肝癌方面的研究尤為重要[3]。大量數(shù)據(jù)表明，肝癌β-catenin的異常改變與Wnt信號激活有關(guān)系，β-catenin在腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色[4-5]。莪術(shù)是姜科姜黃屬植物的根莖，中醫(yī)認(rèn)為其功能多樣，如消積、破淤、行氣及止痛等，同時具有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等作用[6]。研究顯示，從莪術(shù)中提取的β-欖香烯在抗腫瘤方面作用顯著，不良反應(yīng)較少，對患者生存質(zhì)量有明顯改善作用[7-8]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討莪術(shù)提取物介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路對肝癌細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TRIzol 試劑（浙江AMEKO 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢賽維爾公司）；RT-PCR 試劑盒（上海優(yōu)予公司）；β-欖香烯（廣東中山成諾生物公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海博升公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海撫生實業(yè)公司）；Hep-G2 人肝癌細(xì)胞（上海奧陸生物公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

取Hep-G2 細(xì)胞常規(guī)接種培養(yǎng)，待Hep-G2 細(xì)胞密度生長為60%～80%時，在培養(yǎng)液中加入β-欖香烯，按照所加入濃度將Hep-G2 細(xì)胞分為20、50、100 μg/mL 組，將各組Hep-G2 細(xì)胞 置 于16 孔板中培養(yǎng)，以不加入β-欖香烯培養(yǎng)液作為正常對照組，4 組培養(yǎng)48 h 后，棄去上層清液，更換培養(yǎng)基， 培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.3 RT-PCR檢測各組Hep-G2 Wnt1、β-catenin mRNA水平變化

采用TRIzol 法來提取Hep-G2細(xì)胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按說明書操作，用DNA 熒光染 料SYBR Green Ⅰ對Wnt1、β-catenin 表 達(dá) 水 平進(jìn)行檢測，各引物序列見表1，內(nèi)參采用β-actin，60 ℃、10 min，95 ℃、72 ℃， 各 30 s，95 ℃、 5 min，循環(huán)次數(shù)以40為準(zhǔn)，實驗次數(shù)至少3次，用相對定量2-ΔΔCT計算Wnt1、β-catenin mRNA水平。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.4 免疫印跡檢測各組Hep-G2 細(xì)胞Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)

將Hep-G2 細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進(jìn)行測量，分裝后6 孔板中加入 100 μg 的胰蛋白酶提取液，再注入2 mL 培養(yǎng)基，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1 的比例混勻，將50 μg 蛋白樣品電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，加脫脂奶粉封閉1 h，加入2 抗室溫封閉1 h，取出PVDF 膜TTBS 漂洗3 次，每次10 min，DAB 顯色后數(shù)碼相機(jī)照相，計算Wnt1、β-catenin 蛋白濃度。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測各組Hep-G2 細(xì)胞凋亡情況

收取各組Hep-G2 細(xì)胞，離心5 min，運用100 μL 結(jié)合緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行重懸，用 5 μL 標(biāo)記lFITC 的Annexin Ⅴ與5 μL PI 染色混勻，無光條件下孵育15 min 后注入400 μL 結(jié)合緩沖液混勻，記錄細(xì)胞凋亡情況。

1.6 劃痕實驗檢測Hep-G2 細(xì)胞遷移能力

各取4 組1×105/mL 細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，12 h 后再加入DMSO，24 h 后離心重懸細(xì)胞為5× 105/mL，將200 mL 細(xì)胞懸液注入Transwell 小室，加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束拭去未遷移細(xì)胞，甲醛溶液固定8 min，結(jié)晶紫溶液染色，半定量計數(shù)，顯微鏡（×100）觀察5 個視野。

1.7 MTT 檢測Hep-G2 細(xì)胞增殖能力

取各組Hep-G2細(xì)胞接種在96 孔板， 每孔200 μL，室溫37 ℃、5%CO2，培養(yǎng)時長不＜ 24 h，每孔加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，與150 μL DMSO 溶液混勻，在酶標(biāo)儀490 nm 處測量各孔的吸光值，分析細(xì)胞活力變化情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Hep-G2 細(xì)胞Wnt1、β-catenin mRNA 及蛋白水平變化

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，正常對照組Wnt1、β-catenin mRNA 水平高于其他3 組，差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義（P＜0.05）， 100 μg/mL 組Wnt1、β-catenin mRNA 水平顯著低于20 μg/mL 組、50 μg/mL 組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組Hep-G2 細(xì)胞Wnt1 和β-catenin mRNA 水平變化Fig 1 Changes in wnt1 and β-catenin mRNA levels in Hep-G2 cells

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，正常對照組Wnt1、β-catenin 蛋白相對表達(dá)高于其他3 組，差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義（P＜0.05）， 100 μg/mL 組Wnt1、β-catenin蛋白相對表達(dá)顯著低于20 μg/mL 組、50 μg/mL 組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組Hep-G2 細(xì)胞Wnt1、β-catenin 蛋白含量Fig 2 Wnt1 and β-catenin protein content in Hep-G2 cells of each group

2.2 各組Hep-G2 細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，正常對照組Hep-G2 細(xì)胞凋亡率顯著低于其他3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）， 100 μg/mL 組Hep-G2 細(xì)胞凋亡率顯著高于20 μg/mL 組、50 μg/mL 組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.3 各組Hep-G2 細(xì)胞遷移能力比較

Transwell檢測結(jié)果顯示，100 μg/mL組Hep-G2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)為（45.69±5.44）個，顯著低于正常對照組的（125.55±12.39）個、20 μg/mL組的（109.49±12.24）個和100 μg/mL組的（87.45±9.34）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

2.4 各組Hep-G2 細(xì)胞增殖能力比較

MTT 檢測結(jié)果顯示，正常對照組Hep-G2 細(xì)胞增殖能力顯著高于其他3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）， 100 μg/mL 組Hep-G2 細(xì)胞增殖能力低于20 μg/mL 組、50 μg/mL 組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

3 討論

肝癌是眾多腫瘤中致死率較高的疾病之一，死亡率占全球疾病死亡人數(shù)一半左右，嚴(yán)重威脅著人類生命和健康[9]。癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移過程十分復(fù)雜，與各種黏附相關(guān)分子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)[10]。莪術(shù)提取物β-欖香烯具有抗轉(zhuǎn)移、不易耐藥、抗癌等功效，在臨床多種腫瘤應(yīng)用中療效顯著[11-12]。運用轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠對Wnt信號通路進(jìn)行研究，結(jié)果顯示W(wǎng)nt 信號通路在肝癌組織中異常激活，并與下游β-catenin 產(chǎn)生作用，對肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用[13]。

中醫(yī)治療肝癌多以活血化瘀、消積散結(jié)為主，莪術(shù)作為常見的活血化瘀的中藥，其提取物β-欖香烯是萜烯類化合物的一種，具有非細(xì)胞毒性特點，其抗癌作用機(jī)制是通過阻礙癌細(xì)胞周期來實現(xiàn)。其次，莪術(shù)提取物β-欖香烯提升腫瘤細(xì)胞的免疫原性，促進(jìn)荷瘤對機(jī)體中免疫細(xì)胞功能的恢復(fù)，毒副作用小，同時不易產(chǎn)生耐藥性[14-15]。有研究證實，β-欖香烯體外抑制肝癌細(xì)胞增殖能力明顯，阻滯癌細(xì)胞生長周期，使其停留在G1期， 達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[16]。本研究結(jié)果顯示，100 μg/mL組Hep-G2細(xì)胞凋亡率最高，其次為20 μg/mL組、50 μg/mL組，正常對照組Hep-G2細(xì)胞凋亡率最低。正常對照組Hep-G2細(xì)胞遷移能力最高，100 μg/mL 組遷移能力最低，50 μg/mL 組遷移能力高于20 μg/mL 組。 100 μg/mL 組Hep-G2 細(xì)胞增殖能力最低，正常對照組細(xì)胞增殖能力最高，50 μg/mL 組細(xì)胞增值能力低于20 μg/mL 組。

圖3 各組Hep-G2 細(xì)胞凋亡率Fig 3 Hep-G2 cell apoptosis rate in each group

圖4 各組Hep-G2 細(xì)胞遷移能力，結(jié)晶紫染色，×200，標(biāo)尺=50 μmFig 4 Hep-G2 cells migration ability in each group， crystal violet staining， ×200， bar=50 μm

圖5 各組Hep-G2 細(xì)胞增殖能力Fig 5 Hep-G2 cell proliferation ability in each group

本研究結(jié)果還顯示，正常對照組Wnt1、β-catenin 表達(dá)水平高于其他3 組，20 μg/mL 組Wnt1、β-catenin 表達(dá)水平最低，20 μg/mL 組Wnt1、β-catenin 表達(dá)水平高于50 μg/mL 組，說明β-欖香烯在一定程度上降低了Wnt1 的表達(dá)，可能通過β-catenin 信號對肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起重要作用。相關(guān)文獻(xiàn)報道，調(diào)節(jié)Wnt 信號相關(guān)蛋白的活性可以產(chǎn)生癌基因作用，而抑制腫瘤癌基因的表達(dá)，可發(fā)揮抑癌基因的作用[17-18]。有研究表明，多數(shù)癌癥患者機(jī)體中β-catenin 的表達(dá)都有提升，異常表達(dá)的Wnt/β-catenin 可加劇機(jī)體免疫細(xì)胞的損傷，如在膠質(zhì)瘤中Wnt 信號表達(dá)受到抑制后，癌細(xì)胞的放射敏感性就會降低，從而提高放療和化療的效 果[19]。Wnt 通路在眾多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，在胃癌和子宮內(nèi)膜癌中的異常變化具有重要參考價值[20]。Wnt通路信號被激活時，靶器官的分化受到限制，干細(xì)胞特異性被保留，會加快肝癌細(xì)胞的分化，導(dǎo)致腫瘤形成[21]。

綜上所述，莪術(shù)提取物在肝癌細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路活性，抑制細(xì)胞增殖和遷移。