程宇凌 孫方正 敖竹君 陳 偉△ 張 瑞

（遵義醫(yī)科大學(xué)，1 附屬貴州省兒童醫(yī)院，2 人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，遵義 563000； 3 畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，畢節(jié) 551603）

Caspase-8 可通過(guò)激活凋亡途徑促進(jìn)乳腺癌的凋亡[1]。慢病毒載體（lentiviral vector，LV）是以HIV-1 病毒（人類(lèi)免疫缺陷I 型病毒）為基礎(chǔ)演變而來(lái)的一種基因治療載體，具有轉(zhuǎn)染效率更高、外源基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在和避免宿主細(xì)胞對(duì)外源基因的切割修飾等優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期研究證實(shí)，Gag-caspase-8 能抑制乳腺癌4T1 細(xì)胞的增殖[2]。本研究將構(gòu)建小鼠乳腺癌荷瘤模型，用攜帶Gagcaspase-8 的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌荷瘤，通過(guò)瘤內(nèi)給藥，觀察各組荷瘤小鼠的一般情況及腫瘤生長(zhǎng)狀況，并檢測(cè)移植瘤caspase-8 蛋白表達(dá)情況，旨在為以caspase-8 為靶點(diǎn)的乳腺癌治療提供進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

4T1 細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。BALB/C小鼠15 只，雌性，5 ～6 周齡，體質(zhì)量17 ～20 g，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（渝）2012-0005。3 種質(zhì)粒（Δ8.2、VSVG、Gagcaspase-8）及PEI 轉(zhuǎn)染試劑由加拿大曼尼托巴大學(xué)敖竹君博士提供；本教研室進(jìn)行慢病毒包裝，DMEM 培養(yǎng)基（高糖）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；免疫熒光一抗與二抗稀釋液購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)公司：兔抗鼠購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司，

1.2 慢病毒載體的轉(zhuǎn)染

用含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/L 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T 細(xì)胞，置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，待細(xì)胞密度增至80%～90%融合時(shí)，消化293T 細(xì)胞，并接種于培養(yǎng)皿中，每皿接種約2×105個(gè)細(xì)胞，鋪皿24 h 后進(jìn)行病毒包裝，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集病毒顆粒。

1.3 小鼠造模及抑瘤實(shí)驗(yàn)

4T1 乳腺癌細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀況良好的15 只小鼠飼養(yǎng)5 d 后，將狀態(tài)良好的4T1 細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，將0.1 mL（l×107/mL 細(xì)胞） 4T1 細(xì)胞接種入小鼠右側(cè)第二乳腺脂肪墊部。從種植第10 天開(kāi)始測(cè)量腫瘤體積大小，每3 d 測(cè)量1 次，直至處死小鼠，并記錄數(shù)據(jù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑（a）及其垂直方向最大橫徑（b），計(jì)算公式V（ mm3）=a×b2/2。第10 天成瘤后將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（注射等量PBS）、Gag-caspase-8 治療組（注射1×106/mL Gag-caspase-8）和Gag 組（注射1×106/mL Gag），給藥為瘤內(nèi)注射，每只小鼠每次0.1 mL，每3 d 重復(fù)給藥1 次，共計(jì)3 次。每日觀察小鼠飲食、精神、活動(dòng)狀況及腫瘤生長(zhǎng)情況。給藥12 d 后，采用脫頸法處死小鼠，無(wú)菌超凈臺(tái)中摘取乳腺癌瘤體及小鼠肺組織，液氮迅速冰凍， -80℃冰箱保存，待進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。從種瘤第10 天（抑瘤第1 天）開(kāi)始，每3 d 定時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量荷瘤的體積大小，并作記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)得最大抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/對(duì)照組平均瘤體積）×100%。

1.4 免疫熒光檢測(cè)荷瘤中caspase-8 的表達(dá)

切片經(jīng)山羊血清封閉，滴加一抗（1∶100），4℃孵育過(guò)夜，滴加二抗羊抗小鼠（2 mg/mL），37℃孵育1 h，PBS 洗滌，滴加抗體，37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌，室溫避光孵育Hoechst 15 min，熒光顯微鏡觀察。

1.5 小鼠移植瘤及肺轉(zhuǎn)移瘤組織切片制備及H-E 染色

瘤體置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，雙蒸水沖洗24 h，再經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋，切片后常規(guī)行H-E 染色，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gag-caspase-8 抑制荷瘤生長(zhǎng)

接種小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞10 d 后，皮下種植部位均出現(xiàn)結(jié)節(jié)，成瘤率達(dá)到100%。小鼠移植瘤的體積變化見(jiàn)圖1。隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，抑瘤效果越來(lái)越明顯，抑瘤第12 天（種瘤第22 天），Gagcaspase-8 治療組移植瘤體積明顯小于對(duì)照組和Gag組[（286.74±112.23）mm3比（671.51±221.93）mm3、（753.06±197.09）mm3，P＜0.01]，Gagcaspase-8 治療組抑瘤率明顯高于對(duì)照組、Gag組（55.34%比6%、0.00%，P＜0.05）（圖1）。

2.2 Caspase-8 蛋白在荷瘤體內(nèi)高表達(dá)

免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，Gag-caspase-8 組caspase-8 蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Gag 組（圖2）。

2.3 Gag-caspase-8 慢病毒顆粒對(duì)荷瘤肺轉(zhuǎn)移的影響

大體解剖觀察，對(duì)照組小鼠肺表面可見(jiàn)多個(gè)大小不等腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，質(zhì)硬；Gag-caspase-8 治療組未見(jiàn)轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)；鏡下見(jiàn)對(duì)照組轉(zhuǎn)移灶內(nèi)正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺組織實(shí)變，乳腺癌樣細(xì)胞排列緊密、紊亂，呈推擠性方式生長(zhǎng)；Gag-caspase-8 治療組肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶（圖3）。

圖1 Gag-caspase-8 慢病毒顆粒抑制荷瘤的生長(zhǎng)。A：第0 天將4T1 細(xì)胞接種入小鼠右側(cè)第二乳腺脂肪墊部，分別于第10 天、第13 天、第16 天將Gag-caspase-8、Gag 及 PBS 進(jìn)行瘤內(nèi)注射，于第22 天處死小鼠；B：游標(biāo)卡尺測(cè)量Gag-caspase-8 組、Gag 組及對(duì)照組瘤體直徑；C：Gag-caspase-8 組、Gag 組及對(duì)照組瘤體體積變化過(guò)程；D：Gag-caspase-8 組、Gag 組及對(duì)照組瘤體質(zhì)量（*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs Gag）.圖2 Caspase-8 在Gag-caspase-8 慢病毒顆粒組荷瘤體內(nèi)高表達(dá)。A：Gag-caspase-8 組；B：Gag 組；C：對(duì)照組；A1 ～C1：DAPI；A2 ～C2：Caspase-8；A3 ～C3：合并。 熒光顯微鏡見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)caspase-8 蛋白呈紅色熒光.圖3 Gag-caspase-8 慢病毒顆粒對(duì)荷瘤肺轉(zhuǎn)移的影響。A：Gag-caspase-8 治療組未見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；B：對(duì)照組小鼠大體解剖觀察肺表面可見(jiàn)多個(gè)大小不等腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，質(zhì)硬（箭頭）；C：對(duì)照組與Gag-caspase-8 組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)比較（*P＜0.05）；D：對(duì)照組見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶，鏡下見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺組織實(shí)變，乳腺癌樣細(xì)胞排列緊密、紊亂，呈推擠性方式生長(zhǎng)，H-E 染色；E：為D 圖高倍視野；F：Gag-caspase-8 組肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶；G：為F 圖高倍視野.Fig 1 Inhibitory effect of Gag-caspase-8 on the growth of mice breast cancer ：In vivo Gag-caspase-8 treatment inhibited mouse breast cancer progress. A： Summary of the experiment：The cells were inoculated into the right mammary fat pad of the 6-week-old female BALB/c mice at day 0. Gag-caspase-8， Gag， or PBS were injected to the center of the tumor mass at day 10， 13， and 16. The mice were sacrificed at day 22； B： Measure the tumor diameter of Gag-caspase-8， Gag and control groups by cursor caliper； C： Mean tumor progression of mice receiving Gag-caspase-8 group， Gag group， or control group； D： Weight of tumor in each group（*P＜0.05 vs control； △P＜0.05 vs Gag）.Fig 2 Representative photomicrographs of DAPI （A1-C1）， caspase-8（A2-B2） and merge（A3-C3） labeling tumor. A：Gag-caspase group；B：Gag group；C：Control group.Fig 3 Effects of Gag-caspase-8 on lung metastasis in breast cancer 4T1 cells in mice. A：Tumor metastasis nodules were not found in treatment group；B： Several hard tumor metastasis nodules of different sizes were observed in the lung surface of control group； C：Comparison of metastatic nodules in the lungs between control group and LV- Gag-caspase-8 group（P＜0.05）. H-E staining of model mice lung； D （low power field） and E（high power field）： Under the microscope， normal alveolar structure disappeared in the metastasis， lung tissue was solid， breast cancer like cells were closely arranged and disordered， and they grew in a pushing manner in control group； F （low power field） and G（high power field）： The lung tissue structure was normal without metastasis in the Gag-caspase-8 group.

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究顯示caspase-8 在乳腺癌腫瘤中低表達(dá)，且與組織學(xué)分級(jí)及腫瘤大小密切相關(guān)，caspase-8 可能參與了乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)慢病毒介導(dǎo)外源性caspase-8 誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的報(bào)道，因此本課題利用可感染分裂期與非分裂期細(xì)胞的慢病毒顆粒作為載體，將外源性caspase-8 導(dǎo)入小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞，抑制了乳腺癌瘤體的生長(zhǎng)，外源性caspase-8 表達(dá)明顯增高。因此推測(cè)慢病毒載體可作為caspase-8 基因的一種可靠運(yùn)載工具，Gag-caspase-8 慢病毒顆?？捎行⑼庠葱詂aspase-8 導(dǎo)入乳腺癌4T1 細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑，caspase-8 通過(guò)酶切活化后經(jīng)異源活化方式激活下游的凋亡蛋白，促進(jìn)乳腺癌4T1 細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抑制乳腺癌瘤體生長(zhǎng)的目的，為尋找特異性抑制三陰性乳腺癌靶向臨床治療提供有效的參考依據(jù)。

乳腺癌是一種易發(fā)生多器官轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，常易轉(zhuǎn)移至肺，其次是肝和骨[5-6]。本實(shí)驗(yàn)利用4T1 乳腺癌小鼠模型，Gag-caspase-8 慢病毒顆粒注射到小鼠瘤體內(nèi)，觀察小鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況，并利用免疫熒光方法檢測(cè)caspase-8 的含量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組移植瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，最大抑瘤率為55.34%，移植瘤體積較對(duì)照組和Gag 組明顯縮??；Gag-caspase-8 組caspase-8 蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，而Gag 組與對(duì)照組相比較基本無(wú)顯著變化；對(duì)照組小鼠較Gag-caspase-8 組相比發(fā)生了明顯的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，表明Gag-caspase-8 對(duì)4T1 細(xì)胞乳腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。

本課題組前期通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，Gagcaspase-8 能降低4T1 乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，使之成為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。綜上所述，caspase-8 通過(guò)慢病毒介導(dǎo)可靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)至小鼠乳腺癌移植瘤，并且可以抑制肺轉(zhuǎn)移和在腫瘤部位發(fā)揮抑瘤作用，增加caspase-8 的表達(dá)，為以Gagcaspase-8 為靶點(diǎn)的新藥開(kāi)發(fā)提供方法及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)支持，并為隨后的治療方法研究提供方向。