李佳蔓，章小毛，郭敬涵，孫思凡，賈玉蝶，鄒少蘭*

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津，300072)2(系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津，300072) 3(發(fā)酵技術(shù)國家工程研究中心(天津)，天津，300072)

總RNA提取和制備是各種以RNA為基礎(chǔ)的技術(shù)前提。這些技術(shù)包括實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)、RNA測序(RNA-seq)、cDNA文庫構(gòu)建、Northern雜交分析等。不同技術(shù)應(yīng)用對RNA提取物的質(zhì)量要求側(cè)重點稍有區(qū)別，但毫無疑問，得率越高、純度越高、完整性越好，后續(xù)的各種RNA工作越方便進行。相比細(xì)菌，酵母的細(xì)胞壁比較厚，難于破碎，如何有效地破碎細(xì)胞壁并保證RNA的完整性，是獲得高質(zhì)量酵母菌總RNA的關(guān)鍵問題[1-4]。到目前為止，釀酒酵母RNA提取已經(jīng)有很多文獻報道，主要方法有(酸)熱酚法[5-6]、水浴法[7]、RNAsnapTM法[8]、一步甲酰胺法[9]等，國內(nèi)外也開發(fā)了商品化試劑盒[4, 10]。但整體上這些方法首先針對對數(shù)期酵母細(xì)胞的RNA提取而研發(fā)；非對數(shù)生長期細(xì)胞[11]，非常規(guī)生長或發(fā)酵條件[2]，各種原因?qū)е碌慕湍讣?xì)胞狀態(tài)變化，都會影響RNA提取方法的效率和效果；在RNA得率和質(zhì)量不能滿足使用基本要求的情況下，提取方法必需先行調(diào)整、摸索和優(yōu)化。

釀酒酵母是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的最重要模式生物之一。釀酒酵母在葡萄糖為碳源的豐富培養(yǎng)基中的典型生長曲線，對數(shù)生長期(exponential phase, EP)之后有二次生長期(post-diauxic phase, DP)和穩(wěn)定期(stationary phase, SP)[12-13]；3個階段的維持和中間轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)機制有多種，其一是cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[13]。cAMP是環(huán)式3′,5′-單磷酸腺嘌呤核苷(3′,5′-cyclic adenosine monophosphate)，簡稱環(huán)磷酸腺苷，是普遍存在于生物機體內(nèi)并在生物機體的功能調(diào)節(jié)中起著十分重要作用的生理活性物質(zhì)，被稱為第二信使[14]；PKA是酵母蛋白質(zhì)激酶(protein kinase A)；cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及細(xì)胞生長和發(fā)育調(diào)節(jié)，有著極為廣泛的功能[12-14]。

本課題組在多年cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究基礎(chǔ)上獲得了高分泌cAMP的酵母菌株，對影響胞外cAMP產(chǎn)量高低的各種因素進行了初步評價和優(yōu)化[15-17]。在前期釀酒酵母研究過程中，RNA提取與應(yīng)用是經(jīng)常性的工作；無論qRT-PCR、Northern雜交分析和cDNA文庫構(gòu)建等，基本都選擇使用對數(shù)生長期細(xì)胞，利用商品化RNA提取試劑盒進行提取，所得RNA提取物都能滿足下游使用要求。而在胞外cAMP高產(chǎn)菌株的發(fā)酵機制與代謝調(diào)控研究工作中我們發(fā)現(xiàn)：cAMP生產(chǎn)菌株發(fā)酵時間長，cAMP的胞外分泌和積累貫穿生長曲線的上述3個階段[15-17]，僅僅進行對數(shù)生長期的分析是遠遠不夠的。為此，我們在前期建立的對數(shù)生長期細(xì)胞RNA提取與利用基礎(chǔ)上，對比考察了不同生長階段細(xì)胞的RNA提取效果，并進行了初步優(yōu)化；本文報告了不同生長階段細(xì)胞RNA提取效果的對比及初步優(yōu)化的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與引物

釀酒酵母G2為本實驗室前期工作中構(gòu)建的具有一定胞外cAMP 生產(chǎn)能力的工程菌[17]。本實驗用到的引物對如下：(1)檢測ACT1基因：ACT1-UP：5′-TTATTGATAACGGTTCTGGTATG-3′，ACT1-DW：5′-CC TTGGTGTCTTGGTCTAC-3′，PCR產(chǎn)物預(yù)期長度100 bp；(2)檢測CYR1基因：CYR1-UP：5′-GTCTTCCACTTCCTCATCTT-3′，CYR1-DW：5′-TATTATCCTGCTCTC GGTTG-3′，PCR產(chǎn)物預(yù)期長度119 bp。引物對使用Primer Premier軟件設(shè)計，蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基與活化培養(yǎng)

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物10、蛋白胨A 20、D-葡萄糖20，固體培養(yǎng)基則還需添加瓊脂粉15；均購于上海生工技術(shù)有限公司。從甘油管中劃線接種YPD平板活化，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d至長出單菌落；然后挑取單菌落接種液體YPD培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)約16 h；需要時再轉(zhuǎn)接二次液體培養(yǎng)活化。

1.1.3 試劑與儀器

直徑500 μm玻璃珠(CAT#:11079105，Biospec)；柱式真菌RNAout試劑盒(CAT#:80804-50)、UV型核酸染料綠如藍(CAT#;70303-1.5)、DNase(CAT#:90903-1000)，北京天恩澤；瓊脂糖H(CAT#:9 012-36-6),上海生工；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CAT#:04897030001)，Roche；熒光定量PCR試劑盒SYBR Green I(CAT#:FP205-02)，TIANGEN。

TU-1810紫外分光光度計，普析通用；S-10酶膜儀，西爾曼科技；BD115恒溫培養(yǎng)箱，Binder；SM-30水平軌道式搖床，Edmund Bühler；FP120細(xì)胞破碎儀，Thermo Savant；IID超聲波細(xì)胞粉碎機，SCIENTZ；Pico 17高速離心機、88880018渦旋振蕩器，Thermo SCIENTIFIC；Q5000超微量紫外分光光度計，Quawell；P25標(biāo)準(zhǔn)型凝膠電泳儀，Biometra；M030723紫外線透射儀，UVitec；LightCycler 480 II實時熒光定量PCR儀，Roche；2100 Bioanalyzer生化分析儀，Agilent。

1.2 生長曲線測定及分析

使用250 mL搖瓶，裝液量為60 mL YPD培養(yǎng)基；接種新鮮活化種子液，控制起始A600=0.2，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)7 d。定時取樣進行如下分析：(1)A600測定；(2)酶膜儀葡萄糖濃度測定，按照說明書操作；(3)鏡檢觀察和計數(shù)；(4)以單管分裝菌液，立即凍存于-80 ℃，供總RNA提取用。設(shè)置3個重復(fù)。結(jié)果使用典型的、有代表性的數(shù)據(jù)。

1.3 酵母細(xì)胞壁破碎

1.3.1 珠打法破碎酵母細(xì)胞

按設(shè)備說明書并參考文獻[4]進行操作。取適量菌液到2 mL細(xì)胞破碎儀專用離心管中，10 000×g、1 min、4 ℃離心，棄上清液，細(xì)胞沉淀用無菌超純水洗滌3次；500 μL無菌超純水重懸；加入300 μL玻璃珠，振蕩30 s、靜息120 s(期間樣品置于冰上)，1～20個循環(huán)。取適量體積破碎液直接或適當(dāng)稀釋后鏡檢觀察和計數(shù)，計算細(xì)胞破碎率；下同。

1.3.2 液氮研磨

同1.3.1收集菌體；參照文獻[1]中的方法，將菌體轉(zhuǎn)移至研缽中，立即加入適量液氮，迅速研磨至液氮全部揮發(fā)，重復(fù)3次研磨操作。用適量無菌超純水重懸研磨后的菌粉，計數(shù)。

1.3.3 反復(fù)凍融

同1.3.1收集菌體和重懸；參照文獻[1]中的方法，將離心管迅速置于液氮中冷凍3 s，取出后立即于37 ℃水浴解凍，直至菌液徹底融化；重復(fù)以上操作3次。

1.3.4 超聲波破碎

同1.3.1收集菌體，1 mL無菌超純水重懸；參照廠家推薦的釀酒酵母破壁參數(shù)操作，即超聲波細(xì)胞粉碎機功率380 W，工作2 s，間歇3 s，超聲破碎5 min，視鏡檢情況增加處理次數(shù)。

1.3.5 渦旋振蕩

同1.3.1收集菌體和重懸；參照本實驗室釀酒酵母DNA提取破壁條件，加入300 μL玻璃珠，渦旋振蕩5 min，視鏡檢情況增加振蕩次數(shù)。

1.4 釀酒酵母細(xì)胞總RNA提取

取-80 ℃凍存菌液，冰上自然緩慢解凍，按照RNA提取試劑盒說明書進行操作。具體操作步驟如表1所示。

表1 天恩澤柱式真菌RNAout試劑盒RNA提取步驟Table 1 TIANDZ Column Fungal RNAout operating steps

當(dāng)插入珠打法細(xì)胞破碎步驟時，表1步驟1改在同1.3.1里的專用管里進行，然后按步驟2加入試劑，同1.3.1加入玻璃珠后用細(xì)胞破碎儀振蕩破碎，繼續(xù)步驟3及后續(xù)提取操作。

1.5 RNA提取物分析

1.5.1 分光光度計測定

按說明書操作，分別測定RNA提取物在230、260、280 nm處的吸光度，并自動計算總RNA的質(zhì)量濃度(ng/μL)及A260/280、A260/230比值。需要時對樣品進行稀釋。重復(fù)3次測定，計算平均值。

1.5.2 瓊脂糖凝膠電泳分析

取800 ng RNA提取物，混合上樣緩沖液后加入到10 g/L瓊脂糖凝膠加樣孔中，在0.5×TAE緩沖液中電泳。核酸染料體積分?jǐn)?shù)0.005%，電泳電壓5 V/cm，電泳時長30 min。電泳結(jié)束后利用紫外線透射儀進行分析。

1.5.3 RNA完整值(RNA integrity number，RIN)分析

取1～5 ng RNA提取物，使用生化分析儀，按說明書操作，由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.6 qRT-PCR分析

1.6.1 反轉(zhuǎn)錄

按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，體系及反應(yīng)條件如下：(1) 2 μg RNA，1 μL Oligo dT，補RNase free H2O至13 μL，65 ℃保溫10 min；(2) 冷卻后加入如下組分：4 μL 5×Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer，0.5 μL Protector RNase Inhibitor，2 μL Deoxynucleotide Mix，0.5 μL Transcriptor Reverse Transcriptase，輕輕吹打混勻，先50 ℃保溫60 min，然后85 ℃保溫5 min。

1.6.2 qRT-PCR分析

按qPCR試劑盒說明書進行操作，體系及反應(yīng)條件如下：(1) 25 ng核酸模板(RNA提取物或cDNA)，0.3 μmol/L上游引物，0.3 μmol/L下游引物，10 μL SYBR Green I，補水至20 μL；(2) 95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母G2在YPD培養(yǎng)基中的生長和糖耗曲線

菌株G2在20 g/L葡萄糖培養(yǎng)基YPD中的生長和糖耗曲線如圖1所示。葡萄糖在20 h左右耗盡；綜合糖耗和生長情況，生長3階段對應(yīng)時段分別為：對數(shù)生長期(EP)9～20 h，二次生長期(DP)20～48 h，48～60 h間進入穩(wěn)定期(SP)。

圖1 酵母菌株G2在YPD中的生長和糖耗曲線Fig.1 The growth curve and glucose curve of strain G2 in YPD medium

2.2 三階段菌液試劑盒方法提取總RNA效果對比

為了簡化情況，不同階段總RNA提取效果的分析選擇3個時間點菌液進行(16、36、60 h)；分別對應(yīng)和代表圖1所示生長3階段。RNA提取效果通過如下3個方面的分析和相應(yīng)指標(biāo)進行對比判斷。

2.2.1 分光光度計測定和得率計算

RNA提取物的分光光度計測定和相應(yīng)得率計算結(jié)果如表2所示。一般認(rèn)為若A260/280值在1.9～2.1、A260/230值在2.0附近，表明樣品純度較好，沒有明顯的碳水化合物(糖類)、鹽類、有機溶劑污染或蛋白殘留。由表2可知，3個時間點RNA提取物樣品都沒有明顯的核酸以外前述物質(zhì)的污染，純度較好；3個時間點的得率差異極為顯著。

表2 不同時間RNA提取物吸光度測定值和得率Table 2 RNA absorbance and yield at different growth times

2.2.2 RNA提取物電泳

RNA提取物樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。16 h RNA提取物樣品28S、18S、5S條帶清晰，而36 h則出現(xiàn)了顯著的變化，條帶相對彌散、模糊。需要說明的是60 h RNA提取物樣品濃度太低，給電泳、反轉(zhuǎn)錄和qPCR各環(huán)節(jié)與16、36 h RNA提取物樣品完全平行的操作設(shè)計帶來很大不便，同時也影響它自身效果判斷；尤其電泳上樣量大，因此這里放棄了60 h RNA提取物樣品的電泳分析。

圖2 RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions

2.2.3 qPCR測試和RNA提取物DNA污染判斷

RNA提取物里的DNA污染情況是判斷RNA提取物質(zhì)量和確定其能否被正式使用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。簡單的檢測方式是以RNA提取物為模板進行常規(guī)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳觀測不到目的條帶時，視為RNA提取物里的DNA污染可以忽略。本實驗為了便于量化比較不同階段RNA提取物的DNA污染程度，同時量化比較DNA污染對不同表達豐度基因定量PCR的背景干擾程度，選擇qPCR方式進行DNA污染檢測。在預(yù)實驗分析的基礎(chǔ)上，選擇ACT1基因和CYR1基因分別為高、低豐度表達的基因代表，使用引物對ACT1-UP/ACT1-DW、CYR1-UP/CYR1-DW，分別以RNA提取物和反轉(zhuǎn)錄所得cDNA樣品為模板，控制相同的核酸模板量和完全一樣的條件進行qPCR。2種模板對應(yīng)CP(crossing point)值的差值簡寫為ΔCP(RNA-cDNA)。CP值和ΔCP(RNA-cDNA)結(jié)果分別如圖3和圖4所示。

圖3 不同時間CP值Fig.3 CP value change during different growth times

圖4 qPCR方法檢查RNA提取物DNA污染情況Fig.4 RNA purity test by qPCR method

由圖3和圖4可知，ACT1基因和CYR1基因的表達中，以RNA提取物為模板的CP值一般認(rèn)為≈35或≥35，說明RNA提取物中無DNA污染或其中DNA污染可以忽略；圖3顯示16 h樣品DNA污染可以忽略，而36 h和60 h樣品則存在一定程度的DNA污染；如圖4所示ΔCP(RNA-cDNA)的變化，說明基因的表達水平隨時間延長而下降，同時來自DNA污染的背景干擾相對增加；而ACT1基因的ΔCP遠遠高于CYR1基因的ΔCP，說明DNA污染所致背景干擾的程度與基因表達豐度有關(guān)，豐度越高、DNA污染背景干擾程度相對越低，反之亦然。

2.3 五種酵母細(xì)胞壁破碎效果比較

上述結(jié)果初步證明3個階段的RNA提取物得率、完整性和DNA污染程度彼此差異顯著；對數(shù)期細(xì)胞能很容易地獲得較好的提取效果，工作方便，無需進一步純化就能用于下游應(yīng)用。另外2個階段的菌液RNA提取首要問題是得率低，其次是存在完整性和DNA污染問題。

如前言所述，細(xì)胞壁的有效破碎和RNA完整性之間是一個矛盾；而DNA污染問題則可以通過DNase消化解決。因此，本文首先嘗試從提高細(xì)胞破壁率的角度來改進36 h和60 h細(xì)胞的RNA提取效果。參考文獻[1-4]選擇珠打法(bead beating)、液氮碾磨、反復(fù)凍融、超聲波破碎和加玻璃珠渦旋振蕩5種方法，首先檢查對60 h細(xì)胞的破壁效果，然后結(jié)合使用破壁步驟和試劑盒提取RNA。由表3和圖5可知，以破壁率來說，珠打方法破壁效果最好，玻璃珠渦旋振蕩和液氮研磨次之；反復(fù)凍融和超聲波破碎方法過低，放棄進一步考察；對所得破碎細(xì)胞液進一步進行RNA提取操作，玻璃珠渦旋振蕩方法不僅得率低，RNA完整性也較珠打和液氮研磨方法差。綜上，選擇珠打破壁法用于后續(xù)的實驗。

表3 不同破壁方法細(xì)胞破壁率和相應(yīng)RNA提取效果比較Table 3 Comparison of cell wall disruption ratio and RNA extraction yield and quality by different methods

1-珠打；2-液氮研磨；3-渦旋振蕩圖5 三種破壁方法所得RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions by three cell wall disruption methods

2.4 珠打法破壁改進總RNA提取效果

2.3的結(jié)果與文獻報道一致，證明珠打勻漿法是最常用也是最有效的酵母細(xì)胞破壁方法之一[1-4]。我們進一步按1.3.1里的操作，取適量上述36和60 h菌液進行更細(xì)致的破壁條件摸索；重點調(diào)整破壁處理循環(huán)數(shù)，以確保細(xì)胞破壁率在99%以上；然后根據(jù)1.4 插入優(yōu)化的珠打勻漿步驟進行RNA提取。所得提取物樣品仍然從同上的3個方面進行評價；為考察RNA提取物能否滿足轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序要求，還進行了RIN測定。

2.4.1 分光光度計測定值和得率

RNA提取物的分光光度計測定和相應(yīng)得率計算結(jié)果如表4所示，16 h樣品RNA提取物得率沒有明顯變化，但36、60 h樣品的RNA提取物得率則分別為2.2.1中得率的5.71、8.60倍，上升顯著；A260/280、A260/230比值反映出RNA提取物純度較高、沒有明顯的核酸以外物質(zhì)的污染。

表4 不同時間RNA提取物吸光度測定值和得率Table 4 RNA absorbance and yield at different growth times

2.4.2 RNA提取物電泳和RIN分析

RNA提取物樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。16 h RNA提取物條帶清晰，且28S與18S RNA倍性關(guān)系明顯，RNA完整性較好；36 h RNA提取物效果較圖2有顯著改進，28S與18S RNA倍性關(guān)系略差于16 h RNA提取物；60 h RNA提取物樣品28S、18S、5S三帶依稀可見，效果與圖2中36 h RNA提取物接近。

圖6 RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions

為進一步確認(rèn)RNA提取物完整性能否達到進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析要求，樣品提交蘇州金唯智生物科技有限公司公司使用生化分析儀和RNA芯片進行了分析，結(jié)果顯示16、36、60 h樣品RNA提取物RIN分別為8.8、7.4和5.3，28S/18S (Area)分別為1.7、1.5和1.6；16、36 h樣品能通過該公司進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析的質(zhì)控要求；而60 h樣品則不能通過。另外，圖2所示試劑盒方法提取16 h RNA樣品也能通過質(zhì)控檢查，完全達到測序分析要求。

2.4.3 qPCR測試和RNA提取物DNA污染判斷

測試CP值結(jié)果如圖7和圖8所示。需要說明的是ACT1基因和CYR1基因的表達：(1) 以RNA提取物為模板的CP值,除了16 h樣品CP值分別為37.30、ND(檢測不到)，36 h和60 h樣品CP值都在34.71～36.07，說明RNA提取物中的DNA污染干擾都可以忽略不計，無需DNase消化；(2)圖7說明2個基因在3個階段都維持表達，表達水平隨時間延長略有下降；(3)2個基因的ΔCP(RNA-cDNA) 值都隨時間延長而下降，說明表達水平隨時間延長而下降的同時，來自DNA污染的背景干擾相對增加；(4)ACT1基因的ΔCP值明顯高于CYR1基因的ΔCP值，說明基因表達豐度越高，DNA污染背景干擾程度相對越低，反之亦然。

圖7 cDNA為模板的CP值Fig.7 CP value change by cDNA as template

綜合前述結(jié)果，試劑盒提取方法能完全滿足16 h對數(shù)生長期細(xì)胞RNA提取的得率和質(zhì)量要求；而添加珠打破壁步驟，則進一步解決了36 h二次生長期細(xì)胞和60 h穩(wěn)定期細(xì)胞RNA提取得率和DNA污染問題，36 h樣品還能滿足RNA測序完整性要求。然而，還存在如下一些問題需要說明和進一步研究予以明確。

圖8 qPCR方法檢查RNA提取物DNA污染情況Fig.8 RNA purity test by qPCR method

2.4.3.1 RNA提取得率和質(zhì)量要求

確如吳思琪等[3]所述，總RNA的人工手動提取和試劑盒提取各有利弊。手動提取不存在試劑盒的最低菌體細(xì)胞量和最小洗脫體積限制，總RNA得率有望遠高于試劑盒提?。坏噭┖蟹椒ǚ奖銓⑿》肿与s質(zhì)、大分子蛋白質(zhì)以及DNA等一并去除，直接得到純度相對更高的樣品，省卻后續(xù)人工提純步驟。本團隊前期也做過一些方法的對比，最終確定在得率和純度能滿足下游應(yīng)用要求的前提下，優(yōu)先使用試劑盒，其相對快速便捷、全程不到30 min(表1)；更方便控制人為操作誤差，相對穩(wěn)定。

本研究中，RNA質(zhì)量是從滿足2個方面的應(yīng)用——qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序完整性要求來進行評價的。qRT-PCR上，DNA污染程度和造成的背景信號干擾程度，是相對于基因的表達豐度而言的；為了同時量化對比不同階段RNA提取物質(zhì)量和DNA污染對不同表達豐度基因qPCR的背景干擾程度，我們選取了ΔCP (RNA-cDNA)指標(biāo)，用于評價基因以及qPCR體系的設(shè)計，以控制CP值在合理的范圍內(nèi)為原則。相比于得率，DNA污染實際是一個相對次要的問題，通過DNAase消化即能解決；但DNAase消化后的進一步提純則是一個需要慎重考慮的問題，因為提純無疑會增加操作步驟、降低得率，使試劑盒優(yōu)勢大打折扣。

一般認(rèn)為，振蕩是破碎酵母細(xì)胞壁的一個有效方法，但在提高得率的同時，可能與RNA完整性矛盾，因此，必需小心控制振蕩的條件[1-4]。本研究中，參考文獻[1-4]選擇的5種方法對比考察證明了珠打法破壁的優(yōu)勢，即操作快速簡便、能同時多管操作和提高破壁率。如圖2、圖6和RIN測定結(jié)果所示，珠打法對16 h對數(shù)生長期細(xì)胞沒有明顯效果，一方面說明試劑盒就能很好解決對數(shù)生長期細(xì)胞的破壁問題，另一方面也說明珠打本身不會特別導(dǎo)致RNA斷裂而破壞RNA完整性；而珠打法處理的36 h細(xì)胞RNA提取物也能達到轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序要求，更說明了本研究中的珠打步驟沒有明顯影響RNA完整性。

2.4.3.2 三個階段細(xì)胞及RNA提取差異分析

本研究選取了3個時間點對應(yīng)3個階段，來說明細(xì)胞狀態(tài)變化對RNA提取得率與質(zhì)量的影響。事實上這僅僅是一個初步調(diào)查；適當(dāng)延長培養(yǎng)時間，縮短取樣間隔，適當(dāng)增加分析取樣點和檢測指標(biāo)，能更準(zhǔn)確地劃分各個生長階段，更完整、可靠地反映整個生長曲線過程中的變化規(guī)律；而本研究菌株在生長過程中分泌的胞外cAMP，對整個階段細(xì)胞狀態(tài)進而對RNA提取的影響，還有待更深入的調(diào)查。

2.5.3.3ACT1基因表達

ACT1基因是人們常用的釀酒酵母qRT-PCR分析內(nèi)參基因之一；但事實上有研究報道整個生長或發(fā)酵階段它的表達并不穩(wěn)定，尤其穩(wěn)定期甚至檢測不到，因此被認(rèn)為它并不是最合適的內(nèi)參基因[18-19]。本研究中，基于3階段RNA提取物及其cDNA為模板的預(yù)實驗結(jié)果，將其選作高豐度表達的基因代表，而圖3和圖6的結(jié)果則進一步證明了ACT1基因在穩(wěn)定期仍然維持較高水平的表達。本研究使用的菌株cAMP生產(chǎn)相關(guān)性能應(yīng)該是本研究結(jié)果與文獻報道不同的主要影響因素之一。進一步的分析還在進行中。

3 結(jié)論

綜上，本研究考察了cAMP生產(chǎn)酵母菌株G2在YPD培養(yǎng)基中不同生長階段的總RNA提取效果，并進行了初步改進研究。選擇16 h對數(shù)生長期細(xì)胞、36 h二次生長期細(xì)胞和60 h穩(wěn)定期細(xì)胞，分別用試劑盒提取，RNA得率依次為1 010.6、171.5和91.3 ng/A600。以ACT1和CYR1為高、低豐度表達的基因代表，進行qRT-PCR的同時判斷DNA污染情況；瓊脂糖電泳和RIN測定判斷完整性；結(jié)果顯示36 h和60 h RNA提取物都存在DNA污染和完整性較差問題。添加珠打破壁步驟破碎細(xì)胞，顯示對16 h細(xì)胞的RNA提取效果沒有明顯變化，但36 h和60 h得率分別提高至979.6和785.6 ng/A600，為前述值的5.71倍和8.60倍，且樣品純度能滿足qRT-PCR要求，36 h樣品能滿足RNA測序要求。分析細(xì)胞3個階段中的狀態(tài)變化是決定RNA提取階段性特征的根本原因。本研究結(jié)果將有助于推動建立酵母生長全階段RNA分析技術(shù)和深化cAMP途徑相關(guān)調(diào)控機制的認(rèn)識。