劉慧意 薛玉梅

機械轉(zhuǎn)導將物理力轉(zhuǎn)化為生化反應,是存在于所有生物體的重要信號傳導機制[1]。自從1980年人們發(fā)現(xiàn)存在直接由機械力激活的離子通道,越來越多人對這些離子通道的蛋白質(zhì)感興趣。通過膜片鉗電生理技術,人們在哺乳動物的多種類型細胞中觀察到了機械敏感離子通道的活動,包括背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元、內(nèi)耳毛細胞、結(jié)節(jié)神經(jīng)節(jié)的主動脈壓力感受器神經(jīng)、腎小球系膜細胞、肺動脈平滑肌細胞和骨骼肌管[2]。細菌中機械敏感的離子通道的分子成分已經(jīng)研究得很清楚,然而直到現(xiàn)在,高級物種中的機械激活通道的分子成分還不是很清楚。

近年來,科學家們通過siRNA篩選,在表達的機械激活電流的成神經(jīng)細胞瘤細胞系中發(fā)現(xiàn),Piezo蛋白是機械激活通道的基本組成部分。這種方法發(fā)現(xiàn)了存在于許多機械敏感組織中的兩種蛋白質(zhì)家族,即Piezo1和2。Piezo1和Piezo2是不同機械激活離子通道的必要組成部分[3]。人造液滴脂質(zhì)雙分子層實驗表明,Piezo1的機械敏感性是固有的,不需要其他蛋白質(zhì)或第二信使信號激活[4]。Piezo1廣泛分布于血管內(nèi)皮細胞中,因此它在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起了相當大的作用[5－8]。近年來,Piezo1及其相關分子作為治療許多心血管疾病的新靶點而被廣泛研究。

1 Piezo1蛋白的結(jié)構

Piezo1由Piezo1/FAM38A基因編碼,位于16號染色體上。人Piezo1包含2 521個氨基酸,piezo1蛋白是具有24-40個跨膜結(jié)構域的大型整體膜蛋白,也是具有最多跨膜結(jié)構域的蛋白[3]。Piezo1具有離子導電孔,它具有許多內(nèi)源性陽離子機械敏感離子通道共有的電生理特性,具有約0 m V的逆轉(zhuǎn)電位,電壓依賴性失活和肽Gs MTx4的抑制作用[9]。Piezo1蛋白的結(jié)構信息首次在小鼠中發(fā)現(xiàn),該蛋白與人Piezo1高度同源。3個Piezo1組裝在一起形成了功能體,每個Piezo1約為300 k Da,并且都是糖基化的[6,10]。Piezo1蛋白的結(jié)構是一種類似三葉螺旋槳的三聚體,包括一個中央孔結(jié)構域和三個外周擴展翼。其中央孔模塊頂部上方的C末端胞外結(jié)構域形成了帶有負電荷殘基的“帽”結(jié)構,決定了Piezo1選擇性通透陽離子Na＋、K＋、Ca2＋和Mg2＋,略微偏向Ca2＋[6]。三聚體的側(cè)面朝上,可以將膜壓向細胞質(zhì),這個特征對感測力至關重要。嵌入膜中的區(qū)域由3組38個α螺旋組成,并帶有額外的細胞內(nèi)α螺旋和約9 nm細胞內(nèi)束。這些葉片包括通過非結(jié)構化區(qū)域與其相鄰束連接的4個螺旋束。每個亞基的最后2個C端α螺旋(37和38)在結(jié)構中處于中心并形成離子孔區(qū)域,C末端細胞外結(jié)構域在頂部之間和上方。孔隙調(diào)節(jié)滲透。葉片呈弧形彎曲,其外部區(qū)域相對于孔隙區(qū)域的平面升高。產(chǎn)生了倒置的圓頂形或鐘形凹痕,提示此處用于能量存儲,該能量隨膜片張力成比例地調(diào)節(jié)門控通道。機械計算表明,通道周邊以外的膜環(huán)境變化會產(chǎn)生特殊的印跡,從而決定張力的敏感性[10－11]。Piezo1在皮膚、膀胱、腎臟、肺、內(nèi)皮細胞、紅細胞和牙周膜細胞中廣泛表達。

2 Piezo蛋白的藥理學

Yoda1能夠激活Piezo1。在微摩爾范圍內(nèi),Yoda1將Piezo1的壓力效應曲線移向較低的壓力值,并顯著減緩了Piezo1的失活[6,12－15]。Yoda1應用于內(nèi)皮細胞,可增加細胞內(nèi)鈣水平,影響蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)磷酸化以及ATP釋放。重要的是,即使在沒有機械刺激的情況下,添加Yoda1也會增加Piezo1的通道活性。Yoda1包含兩個氯和一個硫醚基團,這都是打開Piezo1的關鍵條件[13]。動力學分析表明,Yoda1主要穩(wěn)定Piezo1的打開狀態(tài)[13]。值得注意的是,Yoda1還可以在重構人造雙層膜打開Piezo1,即Yoda1不需要其他蛋白質(zhì),可以直接作用于Piezo1和(或)脂質(zhì)雙層。這些發(fā)現(xiàn)表明在沒有任何機械刺激的情況下,存在可以打開Piezo1的天然激動劑。最近,人們合成了名為Dooku1的Yoda1類似物,并顯示出它通過競爭特定的通道結(jié)合位點可逆地拮抗Yoda1誘導的Piezo1激活[12,15]。

辣椒堿在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元或異源表達系統(tǒng)中激活辣椒素受體離子通道1(transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)通道,后者通過消耗磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]及其前體磷脂酰肌醇4-磷酸[PI(4)P]抑制Piezo1通道(通過Ca2＋誘導的磷脂酶Cδ(PLCδ)激活從質(zhì)膜中獲取[PI(4)P][13,16]。此外,PI(4,5)P2和PI(4)P應用于膜貼片可防止Piezo1活性下降。膜磷酸肌醇上調(diào)Piezo1的作用還表明內(nèi)源性脂質(zhì)可能充當天然的Piezo開孔劑[13,16]。

在機械激活通道研究中還使用其他幾種試劑和化合物,包括鑭系元素Gd3＋和La3＋、氨基糖苷類抗生素(例如鏈霉素和慶大霉素)以及從蜘蛛小夜蛾的毒素中分離出的Gs MTx-4肽[17],Gs MTx4在低微摩爾濃度下對Piezo1有效,并且僅在從細胞外側(cè)施用時才抑制通道[12]。Gs MTx4充當通道調(diào)節(jié)器,將激活的中點轉(zhuǎn)移到更高的壓力值。毒素通過插入脂質(zhì)雙分子層和修飾脂質(zhì)通道界面起作用,因此可能影響許多離子通道[5]。這些抑制劑都不是Piezo1特有的,它們同時還是其他許多離子通道的抑制劑,如瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)通道[18]等。另一類化合物,例如兩親氯丙嗪,可以激活原核和真核機械激活通道[12]。除了這些“典型”的機械激活通道阻滯劑和激活劑外,還有更具體的化合物僅影響某種類型的機械激活通道。例如,釕紅可阻斷Piezo1[12]。釕紅對Piezo1的抑制作用與電壓有關,這是孔阻滯劑的共同特征,反映出它們對離子流方向性的依賴性[2]。

3 Piezo1通道與人類疾病

Piezo1突變與兩種主要類型的疾病有關[5]。常染色體顯性突變(M2225R和R2456H)導致Piezo1信號增強,與脫水遺傳性造血細胞增多癥有關。脫水遺傳性造血細胞增多癥的特征在于滲透性驅(qū)動的紅細胞脫水,脫水的紅細胞中總陽離子和鉀含量降低,但Na＋和水卻沒有成比例的凈增加,可導致溶血性貧血[11,19]。突變型Piezo1通道滅活速率比野生型慢,并且激活潛伏期延長,這表明突變可能增加陽離子滲透性,導致紅細胞脫水,這也表明了該通道在紅細胞體積穩(wěn)態(tài)中的關鍵作用[9,20]。Piezo1隱性功能喪失突變導致先天性淋巴發(fā)育不良,導致淋巴液泄漏到四肢及胸腔中,產(chǎn)生胸腔積液等[21]。此外,成年淋巴瘤中條件性的Piezo1失活導致大量的淋巴瓣變性[21]。在培養(yǎng)的淋巴內(nèi)皮細胞中,Piezo1敲除抑制了由剪切應力誘導的淋巴瓣特征基因的上調(diào)[21]。相反,在沒有機械刺激的情況下,由Yoda1激活Piezo1可以加速動物的淋巴瓣形成,并且還觸發(fā)了培養(yǎng)的淋巴內(nèi)皮細胞中淋巴瓣基因的上調(diào)。同樣,用Yoda1激活Piezo1會誘導培養(yǎng)的淋巴內(nèi)皮中的放線菌素和細胞粘附表面的重塑[22]。簡而言之,在內(nèi)皮細胞中敲除Piezo1后,集體遷移,肌動蛋白聚合和細胞間連接重塑受損[22]。這些發(fā)現(xiàn)表明,Piezo1的剪切應力激活是淋巴瓣形態(tài)發(fā)生的關鍵機制[21－22]。小鼠遺傳學研究已確定,轉(zhuǎn)錄因子、粘附蛋白和細胞間信號傳導介質(zhì)是淋巴管系統(tǒng)和瓣膜的發(fā)育和維持的重要組成部分。此外,機械力也參與淋巴管系統(tǒng)發(fā)育和維持。應當指出,Piezo1是一種廣泛表達的離子通道,尚不清楚其調(diào)節(jié)發(fā)育和生理的完整程度[6]。

4 Piezo1在心血管疾病的作用

4.1 Piezo1在早期血管發(fā)生中的作用 Piezo1整體敲除導致胚胎死亡,表明該機械敏感離子通道是早期血管發(fā)育的關鍵內(nèi)皮機械傳感器[23－25]。在小鼠胚胎期E8.5之后心臟開始跳動并產(chǎn)生血流,產(chǎn)生剪切應力刺激內(nèi)皮細胞。在E9和E10.5天之間,Piezo1在發(fā)育的心血管系統(tǒng)中表達,尤其是內(nèi)皮和心內(nèi)膜,因此E9是器官形成與成熟的關鍵時期[23－25]。Piezo1也存在于人臍靜脈和胎兒胎盤內(nèi)皮細胞中。成年小鼠中,Piezo1持續(xù)表達于內(nèi)皮細胞和阻力動脈的平滑肌細胞中[25－27]。

Piezo1遺傳基因缺失導致胚胎死亡[23－25]。Piezo1缺陷胚胎在妊娠中期死亡,在E9.5之前血管新生正常,這表明血管新生本身并沒有受到損害,此過程與剪切應力無關。在Piezo1敲除小鼠中,卵黃囊以及胚胎血管組織通常無序且缺乏主要血管,表明Piezo1缺陷會影響內(nèi)皮細胞隨后重構及成熟為大血管[23－25]。缺乏Piezo1的胚胎表現(xiàn)出大量的心包積液,并在E14.5之前死亡,表明心臟循環(huán)功能缺陷[23－25]。內(nèi)皮特異性缺失Piezo1的小鼠會導致相似的表型(如E9.5胚胎血管破壞,E10.5胚胎生長延遲,胚胎早期死亡)表明,血管結(jié)構的缺陷是由內(nèi)皮細胞中Piezo1的缺失造成的。Piezo1是胚胎心臟開始跳動后產(chǎn)生血液灌注的內(nèi)皮感受器,它促使血流進入新生內(nèi)皮血管,刺激血管重構與成熟[1,13,19,28]。同時,Piezo1可介導流體剪切力引起的動脈擴張,以維持成年小鼠的基礎血壓[29]。

4.2 高血壓時動脈平滑肌中的Piezo1導致動脈重構 Piezo1在阻力動脈(如腦動脈)平滑肌中大量表達,而在管狀動脈(如主動脈和腎內(nèi)動脈)中表達很少[30]。動脈平滑肌細胞中的Piezo1條件缺失完全抑制了阻力動脈肌細胞中的機械激活電流。在高血壓情況下,Piezo1開放增強導致細胞內(nèi)Ca2＋含量增加,刺激谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶及交聯(lián)酶,這兩種酶都參與阻力動脈重構。阻力動脈重構使動脈壁增厚,管腔直徑縮小[30]。雖然由腸系膜或大腦動脈的腔內(nèi)壓力升高引起的肌原性收縮與平滑肌細胞Piezo1無關,但該通道在慢性高血壓期參與了阻力動脈的動脈重構[30]。因此,在高血壓狀態(tài)下,平滑肌細胞Piezo1的缺失降低了動脈直徑和介質(zhì)厚度,從而降低了阻力動脈的橫截面積[30]。在體內(nèi),半胱氨酸對谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的抑制可以逆轉(zhuǎn)Piezo1依賴的重構[30]。這些發(fā)現(xiàn)將血管平滑肌細胞的Piezo1開放和臨床相關的動脈重構建立聯(lián)系,現(xiàn)在認為動脈重塑是心血管高?；颊叩闹饕A后指標,因此Piezo1可能是治療高血壓疾病新的靶點[30]。

有研究發(fā)現(xiàn)Piezo1在心肌梗死心力衰竭大鼠心臟中表達增加,并可被血管緊張素受體阻滯劑-氯沙坦所抑制；體外予以血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)刺激新生大鼠心室肌細胞可通過血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT1)受體依賴性途徑上調(diào)Piezo1[31]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)拉伸可激活培養(yǎng)的人和小鼠心臟成纖維細胞的Piezo1表達,促進Ca2＋內(nèi)流,激活下游的p38MAPK,促進白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)分泌,參與心臟重構[8]。然而,也有研究顯示,拉伸人心肌細胞系AC16可下調(diào)Piezo1,降低Ca2＋的釋放,激活Wnt相關的信號傳導途徑,參與調(diào)控心臟收縮[7]。有關Piezo1影響機械應力誘導的心臟重塑的研究十分有限,值得進一步研究。心房顫動(簡稱房顫)患者心肌細胞中鈣調(diào)素(Calmodulin,Ca M)激活Src激酶,活化的Src激酶一方面使細胞核內(nèi)的細胞L型鈣通道(L-type calcium channel,LCC)和縫隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx43)表達下降,另一方面使膜上的L型鈣電流下降,Cx43分布側(cè)邊化,并促進Cx43在非閏盤區(qū)與LCC形成分子復合物,L型鈣電流下降和Cx43分布側(cè)邊化導致心房肌細胞的電重塑和細胞間的傳導障礙,促進房顫的發(fā)生和維持。

高血壓患者所致的高靜水壓刺激離子通道Piezo 1開啟,介導Ca2＋內(nèi)流,細胞內(nèi)鈣增加,激活鈣調(diào)素。由此可以猜想,Piezo1可能是高血壓所致房顫的關鍵機械離子通道,Piezo1在房顫產(chǎn)生和維持中的作用值得進一步研究。

4.3 Piezo1在血管舒張中的作用 在正常和高血壓情況下,動脈血壓受到各種血管舒張因子的控制,這些因子是由于血液流動引起的流體剪切應力而從內(nèi)皮中釋放出來的。這些因素包括NO、內(nèi)皮源性超極化因子和類前列腺素。NO在系統(tǒng)性血壓調(diào)節(jié)中起著主要作用[29]。剪應力激活腸內(nèi)皮細胞中Piezo1從而釋放ATP,ATP通過Gq/G11偶聯(lián)的P2Y2受體起作用,導致血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule1,PECAM-1)/血管內(nèi)皮鈣黏素/血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR2)介導的AKT活化并隨后通過eNOS形成NO[29]。同時,增加的血流量以一種尚未清楚的方式誘導腎上腺髓質(zhì)素從內(nèi)皮細胞中以Piezo1依賴的方式釋放,引起蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)連接降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like,CALCRL)/受體活性修飾蛋白2(Receptor activity-modifying protein 2,RAMP2)受體下游的e NOS 632位點磷酸化,從而進一步增強NO水平[29]。升高NO水平進而介導血管舒張。

成年期內(nèi)皮細胞Piezo1失效(或條件敲除)導致體內(nèi)eNOS磷酸化減弱,NO釋放減少,可能與收縮壓升高有關[29]。Yoda1治療還可使小鼠肺內(nèi)動脈以Piezo1和NO依賴的方式舒張[32]。內(nèi)皮細胞Piezo1通過控制內(nèi)皮細胞Ca2＋和NO的產(chǎn)生,從而促進肺內(nèi)血管舒張,然而在慢性缺氧條件下,Piezo1的內(nèi)皮細胞失效并不影響肺動脈高壓的發(fā)展[32]。在大鼠中,Piezo1也證明可以介導妊娠期子宮動脈的血流依賴性血管舒張[27]。同時,miR-103a調(diào)節(jié)Piezo1表達,并隨后影響內(nèi)皮細胞的功能。高血壓患者中miR-103表達的升高可能會導致內(nèi)皮細胞中Piezo1的表達降低,并隨后抑制內(nèi)皮功能。這可能與急性心肌梗死的發(fā)作有關[33]。

4.4 Piezo1在腸系膜平滑肌中的血管收縮作用 內(nèi)皮細胞分泌的NO、前列腺素、花生四烯酸代謝物、H2O2、CO2、H2S等使平滑肌細胞K＋通道開放。Ca2＋激活的K＋通道也會通過縫隙連接使電耦合致使平滑肌細胞超極化,由此產(chǎn)生的超極化處于靜止狀態(tài),稱為內(nèi)皮依賴性超極化(endotheliumdependent hyperpolarization,EDH)[26,34]。致舒張EDH功能障礙涉及高血壓在內(nèi)的多種疾病狀態(tài),因此認為與EDH作用的許多分子是相關疾病治療的靶點[34]。

Piezo1通道在質(zhì)膜中打開時,引起細胞內(nèi)Ca2＋升高和去極化。在可興奮細胞中,通常會發(fā)生除極,觸發(fā)動作電位,引起心肌細胞收縮等。但在非興奮性細胞(如內(nèi)皮細胞)中,細胞內(nèi)升高的Ca2＋激活NO合酶,產(chǎn)生強大的血管擴張劑NO,引起血管舒張。去極化與內(nèi)皮超極化相反,內(nèi)皮超極化是一種公認的由Ca2＋激活的血管舒張劑機制[6]。在某些類型的血管(如腸系膜動脈)中,通過縫隙連接的有效電傳輸可產(chǎn)生內(nèi)皮和血管平滑肌層的合胞體。在這種情況下,Piezo1通道對內(nèi)皮的去極化作用可能會引起血管平滑肌細胞的去極化作用,當幅度足夠大時,它將激活血管平滑肌細胞的電壓門控Ca2＋通道并驅(qū)動血管收縮。因此,根據(jù)間隙連接傳輸?shù)男?Piezo1可以在不同的血管床中產(chǎn)生不同的反應。例如,在全身體育鍛煉時,內(nèi)臟血管收縮,而骨骼肌灌注保留[6]。當小鼠夜間在跑步輪上運動時,內(nèi)皮細胞中Piezo1缺失顯著降低了升高的血壓。因此,內(nèi)皮Piezo1在運動時有升高血壓的作用,其通過高血流量激活,有抗EDH的作用[34]。

5 小結(jié)

自從發(fā)現(xiàn)Piezo1蛋白作為機械感覺轉(zhuǎn)導分子,對它們的研究已經(jīng)揭示了除機械轉(zhuǎn)導之外的許多意外作用。揭開這些蛋白質(zhì)在細胞,發(fā)育和分化階段的特定作用和對生物的特定作用,將為相關疾病治療帶來極大突破。盡管過去30年來在這一領域取得了進展,但仍然存在許多懸而未決的問題。因此,我們期待未來的發(fā)展,這可能為治療整個機械通道病開辟新的途徑!