凌 媛，李 敏

（國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022）

嵌合型病毒樣顆粒（cVLP）屬改良型病毒樣顆粒（VLP），可利用VLP 的組裝能力進(jìn)行其他非自我組裝疫苗的研究，作為一種技術(shù)平臺，利用某些在形成VLP 起關(guān)鍵作用的組分，如以乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）為載體，在其有效部位插入其他病毒的外源抗原表位，形成一種多表位和多抗原的cVLP 疫苗。VLP具有獨特的免疫學(xué)特性，能通過影響抗原遞呈細(xì)胞發(fā)揮佐劑效應(yīng)，可作為其他佐劑、多肽疫苗和核酸疫苗的整合平臺設(shè)計多種形式的疫苗，包裹核酸或其他小分子物質(zhì)，以及作為分子運載工具靶向性遞送基因或藥物。此外，VLP 還可替代天然病毒在免疫學(xué)檢測中發(fā)揮重要作用。通過基因融合表達(dá)或化學(xué)偶聯(lián)的方法將外源抗原多肽與VLP 偶聯(lián)，構(gòu)建cVLP 疫苗，可呈現(xiàn)除載體以外的其他病毒或腫瘤相關(guān)抗原表位，實現(xiàn)對多種病毒和腫瘤抗原的共同免疫，在預(yù)防病毒、治療腫瘤及過敏性疾病中發(fā)揮重要作用，部分研究已進(jìn)入臨床試驗階段［1］。在此，著重介紹目前常用的VLP 載體病毒結(jié)構(gòu)蛋白和噬菌體的應(yīng)用情況。

1 常用VLP 載體

1.1 HBcAg VLP 載體

HBcAg VLP 是構(gòu)建 cVLP 的常用載體。HBcAg 能形成VLP 的結(jié)構(gòu)，同時自身具有免疫原性、免疫佐劑等特性，是理想的疫苗載體，因此HBcAg VLP 可用來呈現(xiàn)其他外源抗原，構(gòu)建VLP 疫苗，用于抗病毒、細(xì)菌、瘧原蟲、腫瘤等疾病的動物試驗有良好的免疫效果［2］。Sominskaya 等、Apovia 公司和巴斯德以HBcAg VLP 為載體，分別構(gòu)建了含HBV（前S1 蛋白）、丙型肝炎病毒（HCV，高度保守的N端核心表位）抗原、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白中心重復(fù)序列和流感病毒M2 基質(zhì)蛋白胞外功能區(qū)（M2e）的cVLP，動物試驗結(jié)果證明，cVLP 安全、有效［1］。

預(yù)防性乙肝疫苗的普遍接種，大幅降低了肝炎相關(guān)疾病的發(fā)病率，但仍亟待開發(fā)治療性乙肝疫苗。HBV 所致肝癌的發(fā)病率約占原發(fā)性肝癌的50%。有研究報道，利用HBV X 蛋白（HBX）能使腫瘤調(diào)節(jié)蛋白，在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)［3-4］。利用HBcAg 作為免疫載體蛋白，可將其他外源基因插入HBc 基因中，如上面提到的HBX細(xì)胞毒性T 細(xì)胞表位，或人類白細(xì)胞抗原（HLA）-DR結(jié)合表位（PADRE）等其他通用型T 細(xì)胞表位，通過構(gòu)建這種嵌合基因，利用HBcAg 自我組裝能力進(jìn)一步表達(dá)形成VLP，接種藥物的小鼠，在挑戰(zhàn)腫瘤30 d 試驗中可抑制腫瘤生長，同時誘導(dǎo)較強的T 細(xì)胞反應(yīng)［3］。

有研究表明，機體對外源肽段免疫應(yīng)答的強弱很大程度與肽段插入載體的位點有關(guān)，如HBcAg 位置（N 端、C 端或刺突部位）的影響。外源肽段的首選插入位點為HBcAg 的 78 ～83 位氨基酸位點主要免疫顯性區(qū)域（MIR），最多可容納120 個氨基酸殘基，可增強插入肽段的免疫原性；去除該區(qū)域某些特定的氨基酸殘基后，可能會降低 HBcAg 自身的免疫原性［5-6］。N 端截短 4 個以內(nèi)的氨基酸，可連接最多50 個氨基酸殘基，外源肽段很少表達(dá)在HBcAg 顆粒表面；如果在N 端加入PreC 接頭，可促使外源肽段在顆粒表面表達(dá)［7］。C 端常在 144，149，156 位氨基酸位點插入，最多可連接100 個氨基酸殘基，可完全或部分表達(dá)在顆粒表面［2］。盡管在N 端和C 端連接的外源肽段的免疫原性不如插入刺突部位強，但HBcAg 自身依然保持很強的免疫原性，因此插入外源肽段的位點需根據(jù)不同目的而進(jìn)行設(shè)計。如可在N 端或C 端連接HBV 的表位肽，構(gòu)建抗HBV 的疫苗。通常在HBcAg 插入多個連續(xù)的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞表位，能增強機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

1.2 噬菌體載體

目前，國內(nèi)外已制備出多種噬菌體VLP，常用的噬菌體載體是以噬菌體Qβ 和AP205 為呈遞載體遞送各種外源抗原，主要用于非感染性疾病，如過敏、阿爾茨海默?。ˋD）、自身免疫性疾病、2 型糖尿病、腫瘤、高血壓、尼古丁依賴癥等，動物及人體臨床試驗結(jié)果顯示這種cVLP 具有一定的免疫性效果。瑞士Cytos 公司以Qβ 噬菌體VLP 為載體研制了系列治療性疫苗，包括AD 疫苗（CAD106）、尼古丁疫苗（NIC002）、過敏性哮喘疫苗（CYT003-QbG10）等，其中研制的針對血管緊張素Ⅱ的降壓疫苗（CYTOOe-AngQb）已完成Ⅱa 期臨床試驗［8-9］。經(jīng)鼻內(nèi)免疫小鼠以噬菌體Qβ 為載體的 cVLP，能有效誘導(dǎo)小鼠的黏膜免疫和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答；用其呈遞流感病毒M2 蛋白的胞外區(qū)域，經(jīng)鼻內(nèi)免疫后，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強的M2 特異性抗體反應(yīng)和抗病毒作用［10］。

人類免疫缺陷病毒（HIV）gp41 蛋白高度保守的跨膜前域（MPER）可被某些單抗識別，因此可作為HIV 疫苗的中和靶點［11］。通過化學(xué)偶聯(lián)的方式將gp41 肽段轉(zhuǎn)載于噬菌體AP205 載體上構(gòu)建cVLP，免疫小鼠可產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體。根據(jù)選擇的不同肽段，免疫小鼠的血清可中和高敏感的HIV-1 實驗室毒株和不太敏感的原代分離株（不是C 群原代分離株），還具有抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）作用，表明其ADCC 表位可能位于 gp41 的遠(yuǎn)端區(qū)域［11］。

另一種研究策略是將HIV CCR5 蛋白偶聯(lián)到噬菌體 Qβ 載體上，即將獼猴 CCR5（mCCR5）的 2 個肽段，1 個 N 端（EC1）或細(xì)胞外第二表面 loop 區(qū) （ECL2），與噬菌體 Qβ 融合表達(dá)，免疫 Qβ -EC1 或 Qβ -ECL2 后的恒河猴可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗CCR5 抗體。接種該疫苗的恒河猴在進(jìn)行猴免疫缺陷病毒（SIV）攻毒時，其病毒載量低于對照組［12］。

1.3 人乳頭瘤病毒（HPV）L1 VLP 載體

因HPV L1 蛋白是具有二十面體衣殼顆粒的結(jié)構(gòu)特征，其五聚體殼粒的規(guī)則排列保留了其構(gòu)象表位，具有與天然病毒顆粒相似的構(gòu)象表位，目前已上市的HPV 疫苗及其他在研疫苗基本是選擇重組表達(dá)L1 蛋白作為目的基因；由于其分子生物學(xué)及免疫學(xué)特性，HPV L1 蛋白還可作為其他感染性疾病及治療性疫苗的載體。將HPV16 型L1 的C 末端或N 末端部分截短，可插入一定長度的外源氨基酸序列，并不影響病毒樣顆粒的形成，可以用來構(gòu)建cVLP 疫苗。

cVLP 既可表達(dá)自身載體的病毒衣殼蛋白，還可表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的T 細(xì)胞表位，并自行組裝成病毒樣顆粒。以HPV L1 為載體構(gòu)建的cVLP 疫苗用于治療腫瘤等疾病，首先用于治療與載體本身密切相關(guān)的宮頸癌。GREESTONE 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，通過分子生物學(xué)技術(shù)將HPV E7 基因（位于HPV 基因的早期區(qū)，主要功能涉及DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也是治療性HPV 疫苗的研究靶點）與 HPV16 型 L1 或 L2 基因的 C 端結(jié)合，通過昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并提純后的重組蛋白，經(jīng)透射電鏡可觀察到VLP 顆粒結(jié)構(gòu)，動物試驗證明其具有抑制腫瘤生長的作用。卞繼峰等［14］通過pUC質(zhì)粒構(gòu)建了重組pUC19L1-E7，又進(jìn)一步以重組腺病毒 rAd5 質(zhì)粒構(gòu)建 HPV16L1-E7，實現(xiàn)了重組HPV16 L1-E7 融合蛋白在293 細(xì)胞中的高效表達(dá)。Ⅰ期臨床試驗證實，感染了HPV16 型病毒并進(jìn)展至宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）2／3 階段的患者中接近50%在接受最后一針的HPV16 L1-E7 cVLP 疫苗接種后，病灶可縮小50%［15］。另外，還有采用結(jié)合 HPV16 E6 和 E7 的 T 細(xì)胞表位的治療策略［15］。

除用于宮頸癌的治療外，利用HPV 載體還可表達(dá)其他腫瘤相關(guān)抗原，如人黏蛋白MUC-1（一種惡性腺瘤標(biāo)志物）。利用HPV 載體表達(dá)的MUC-1 免疫小鼠，再用MUC-1+的淋巴瘤細(xì)胞系攻毒，免疫小鼠可獲得較強的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時腫瘤進(jìn)展也相應(yīng)減緩［15］。

利用HPV16 L1 表達(dá)HIV 的相關(guān)疫苗研究中，曾將HIV gp160 的細(xì)胞毒性 T 淋 巴 細(xì) 胞（CTL）表位 肽（aa120 ～128，aa814 ～ 823）連接于 HPV16 L1 的 C 末端，構(gòu)建具有VLP 結(jié)構(gòu)的HIV 疫苗，其作為黏膜免疫疫苗口服，可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生HIV 特異的黏膜免疫反應(yīng)和CTL 細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而保護黏膜系統(tǒng)免受HIV 感染。

HPV 免疫原性具有型別特異性，因此有必要開發(fā)具有廣譜交叉保護作用的候選 HPV 疫苗。KANDA 等［16］采用 HPV16 型 L1 和 L2 的抗原表位構(gòu)建 HPV cVLP 疫苗，即將L2 肽段呈遞于L1 蛋白組裝的VLP 表面，將構(gòu)建的cVLP 疫苗免疫家兔后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生具有保護作用的針對L1 和L2 的中和性抗體，且中和抗體可針對高危型HPV18，31，52，58 型假 VLP 產(chǎn)生交叉中和作用［17］。

另外，將HPV45 L2 中和表位插入到HPV18 L1 的表面環(huán)區(qū)，構(gòu)建cVLP（18L1-45RG1）。疫苗免疫后的家兔可產(chǎn)生針對 HPV39，45，68，70（屬 HPV45 和 HPV18同一支系）特異性的中和抗體。小鼠被動免疫該家兔血清后，可耐受 HPV18，39，45，68 型毒株的攻毒［18］。

有研究團隊分析了20 種型別HPV L1 的進(jìn)化關(guān)系，并與其中8 種型別HPV 衣殼粒五聚體晶體結(jié)構(gòu)保守性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)型別特異性的優(yōu)勢中和表位是由表面的型別特異性氨基酸和VLP 保守性整體結(jié)構(gòu)共同組成的；利用基于結(jié)構(gòu)信息的同源替換方法，在一種經(jīng)過分子改造的 3 型別 cVLP（HPV58 ／33 ／32）上實現(xiàn)了各型別HPV 抗原性和免疫原性的平衡，在非人靈長類動物體內(nèi)誘導(dǎo)出3 倍劑量的與野生型混合VLP 相當(dāng)?shù)慕徊婷庖弑Ｗo抗體滴度；利用晶體結(jié)構(gòu)和冷凍電鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)測定揭示了cVLP 產(chǎn)生交叉保護的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。采用以上研究策略設(shè)計了 4 種3 型別 cVLP（HPV16 ／31 ／35，HPV56 ／66 ／53，HPV39 ／68 ／70，HPV18 ／45 ／ 59），通過分子設(shè)計的通用性驗證，目前已制備了7 種 cVLP，可應(yīng)對 20 種 HPV 型別的感染［19］。

1.4 流感病毒VLP 載體

流感病毒VLP 是近年研究的熱點。流感病毒表位易發(fā)生基因漂移和突變，每年世界衛(wèi)生組織（WHO）均需預(yù)測年度流行毒株，并向企業(yè)發(fā)放在雞胚上的適配流感毒株，用于生產(chǎn)傳統(tǒng)流感疫苗。研究人員為制備具有廣譜保護作用的通用型流感疫苗，可利用VLP 載體表達(dá)來自不同流行毒株的HA 或NA 抗原表位，或聯(lián)合表達(dá)某些免疫刺激分子來增強流感抗原的免疫原性。

重組流感病毒cVLP 疫苗目前有采用異源病毒載體表達(dá)HA、NA 或M1 蛋白。在小鼠和雪貂試驗中，免疫H1N1 VLP 可保護動物產(chǎn)生針對同源流感病毒H1N1 的抗體，以及針對異源流感病毒H5N1 的攻毒［20］。與鼻噴免疫途徑相比，肌肉注射免疫途徑還可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生高滴度的免疫球蛋白（IgG 和IgA）抗體，Ⅱ期臨床試驗中也顯示具有較好的耐受性［21］。另外，還有構(gòu)建針對高致病性禽流感病毒H5N1 和H7N9 HA、NA 和M1 的重組cVLP，小鼠接種H5N1 cVLP 疫苗后，在經(jīng)過同源或異源的H5N8 毒株的攻毒后能全部存活；雪貂免疫H7N9 cVLP 疫苗并聯(lián)合佐劑，可獲得針對H7N9 高滴度的中和抗體，肺組織的病毒載量和病毒脫落均較對照組低［22］。

除構(gòu)建同源VLP 的研究外，還有利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含流感病毒蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag 的cVLP，其大小和形態(tài)與逆轉(zhuǎn)錄病毒相似［23］。其他含流感病毒蛋白cVLP的研究中，有將HA 蛋白的胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）S 蛋白胞外區(qū)連接構(gòu)建嵌合基因，共表達(dá)該嵌合基因和流感病毒 M1 蛋白，形成 SARS-VLPs［24］，還有構(gòu)建的水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）cVLP、呼吸道合胞病毒（RSV）-cVLP［25］、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 cVLP［26］、禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）雙價 cVLP［27］等。

另外，將HIV 多個gp41 表位，與流感病毒蛋白偶聯(lián)形成重組 gp41 三聚體（rgp41），其包含保守的gp41 表位，接種該疫苗的恒河猴可抵御13 次異源猴艾滋病毒（SHIV）攻毒，經(jīng)肌肉或鼻內(nèi)途徑接種該疫苗后的恒河猴均獲得了免疫保護，但肌肉注射組僅有50%個體受到保護［28］。

1.5 其他 VLP 載體

除以上常用VLP 載體外，還有采用貓皰疹病毒（FHV）、植物病毒如煙草花葉病毒（TMV）和馬鈴薯病毒X（PVX）等作為VLP 免疫載體。將HIV gp41 高度保守的表位（ELDKWA）采用基因融合的方式插入 PVX 的 N 端［29-31］。免疫該cVLP 的小鼠可產(chǎn)生針對HIV-1 MN gp160 衍生肽（H66）高滴度的 IgG 抗體，并能中和 HIV-1 病毒。此外，該疫苗聯(lián)合人樹突狀細(xì)胞（DCs）可觸發(fā)體內(nèi)外周血單核淋巴細(xì)胞的增殖［29］。

2 cVLP 疫苗在防治腫瘤和慢性疾病中的應(yīng)用

cVLP 疫苗除可用于預(yù)防 HBV、戊型肝炎病毒（HEV）、HPV、HIV 等病毒感染導(dǎo)致的疾病外，還可用于治療淋巴瘤、白血病、黑色素瘤和乳腺癌等腫瘤。腫瘤特異的表面抗原可刺激機體產(chǎn)生特異T 細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，利用噬菌體和植物來源的病毒作為腫瘤抗原的遞送載體，該類載體在自然界中不感染人，也不會在人體中復(fù)制。利用TMV 的外膜蛋白或噬菌體Qβ 表達(dá)腫瘤相關(guān)表面碳水化合物抗原（TACA），該抗原本身免疫原性較低，而通過構(gòu)建的嵌合TMV-TACA 則可以產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體，同樣嵌合Qβ-TACA 也可獲得較強的體液免疫反應(yīng)［32］。

還有表達(dá)全長人表皮生長因子受體-2（HER-2）或其他特異免疫表位的cVLP 疫苗用于乳腺癌的治療，目前已進(jìn)入臨床試驗階段。它是將HER-2 外顯結(jié)構(gòu)域肽段插入重組流感病毒體 （IRIVs）中［33-35］。其中 P4（378-394），P6（545-560）和 P7（610-623）3 個免疫肽段可有效激發(fā)B 細(xì)胞免疫反應(yīng)［36］。臨床試驗結(jié)果顯示，有80%的接種者可獲得特異性抗體，70%的患者免疫后產(chǎn)生HER -2 特異性的IgG 抗體，另外還可觀察到細(xì)胞免疫反應(yīng)，如白細(xì)胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、γ 干擾素（IFN-γ）細(xì)胞因子分泌增加［37］。另一種策略是先對包膜流感病毒VLP 進(jìn)行修飾，將HER-2 錨定在糖基磷脂酰肌醇（GPI）上，由此構(gòu)建cVLP（GPI-HER-2-VLP）。臨床前研究結(jié)果顯示，小鼠抗 D2F2 ／E2 （HER-2 陽性）血清 IgG 抗體增強，動物血清IgG1，IgG2a，IgG2b 水平也相應(yīng)升高，最終達(dá)到輔助性 T 細(xì)胞（Th1和 Th2）反應(yīng)的平衡。

還有采用小鼠多瘤病毒（MPyV）的主要衣殼蛋白（VP1）和次要衣殼蛋白（VP2）作為 VLP 載體的應(yīng)用［38］。采用基因修飾后的 VP2 表達(dá) HER-2 的N 端結(jié)構(gòu)域（包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域）構(gòu)建cVLP（VP2Her21-683），在桿狀病毒表達(dá)體系中可表達(dá)Her21-683Py cVLP 顆粒。免疫后的小鼠進(jìn)行HER-2陽性D2F2／E2 細(xì)胞攻毒，87%的小鼠不會產(chǎn)生腫瘤。

利用植物病毒PVX 構(gòu)建HER-2 陽性cVLP 疫苗的應(yīng)用，將PVX 與含有HER-2 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸387-394 的P4 B 細(xì)胞表位進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較單獨表達(dá)可溶性P4 更高滴度的HER-2 特異性抗體，該抗體可特異識別HER-2 陽性乳腺癌細(xì)胞［39］。

此外，還有針對高血壓和AD 等慢性病進(jìn)行的主動免疫治療。將血管緊張素Ⅱ化學(xué)偶聯(lián)至噬菌體Qβ（AngQb）中，臨床前研究結(jié)果顯示，針對高血壓大鼠模型，接種該疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對血管緊張素Ⅱ高滴度的IgG 抗體，血壓可恢復(fù)正常［40］。還有采用 HPV，噬菌體Qβ，HBc、BPV-1 等 VLP 載體來表達(dá) AD 的 Aβ 肽。其中用HPV 偶聯(lián)Aβ 的N 端結(jié)構(gòu)域可使機體產(chǎn)生高水平的抗體，其抗體滴度高于HPV 偶聯(lián)Aβ 的中間結(jié)構(gòu)域或C 端結(jié)構(gòu)域，表明Aβ 的N 端結(jié)構(gòu)域具有重要的免疫原性。利用噬菌體 Qβ 與 Aβ1-6 進(jìn)行共軛連接，免疫Qβ-Aβ1-6 后的小鼠可產(chǎn)生Aβ 肽特異性抗體，形成的斑塊比對照組少［41］。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示，47 例AD 患者在接受4 次皮下或肌肉注射CAD106 后，可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生Aβ-特異性高滴度抗體［42］。

3 cVLP 疫苗的藥學(xué)研究

3.1 cVLP 疫苗的構(gòu)建與設(shè)計

cVLP 的構(gòu)建主要與中和免疫表位、展示載體的選擇、表位與載體的適配性等研究有關(guān)。通過中和表位選擇有效靶點，利用結(jié)構(gòu)學(xué)的預(yù)測及分析，與VLP 載體構(gòu)建cVLP，再通過生物學(xué)試驗方法（中和試驗和攻毒保護試驗等）篩選出具有中和抗體的cVLP，進(jìn)一步對cVLP的免疫效果進(jìn)行分析。中和免疫表位的選擇與表位長度、表位與載體的適配性有關(guān)，表位與載體適配性又與表位篩選、表位長度、嵌合位點及載體長度有關(guān)；展示載體的研究包括VLP 載體選擇、載體長度與嵌合位點的選擇有關(guān)；之后再通過結(jié)構(gòu)學(xué)預(yù)測分析cVLP 的高級結(jié)構(gòu)。

具體針對重組VLP 疫苗目的基因片段的選擇，其病毒流行株的選擇等是否合理，需結(jié)合對產(chǎn)品免疫原性、安全性及不同毒株間的交叉保護作用等方面進(jìn)行綜合考慮。另外，目的基因序列的選擇需充分考慮對免疫原性、VLP 形成這兩方面的影響。針對多種蛋白構(gòu)建的cVLP 疫苗的設(shè)計，不僅要考慮該疫苗所針對的蛋白，還需考慮對其他載體蛋白可能造成的影響［43］。將外源抗原插入可自我組裝的VLP 后能否有效表達(dá)，并使外源抗原在VLP 表面有效呈現(xiàn)，需進(jìn)行表位與載體適配性研究，載體適配性主要是預(yù)測表位能否較好地嵌入到載體，以及形成的cVLP 結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定，關(guān)系到疫苗整體的免疫原性。包膜VLP 可在自我組裝衣殼蛋白的基礎(chǔ)上以其天然構(gòu)象呈遞外源抗原，而非包膜VLP 主要通過基因融合和化學(xué)偶聯(lián)的方式插入外源抗原，外源抗原的大小會影響VLP 的組裝和抗原的正確表達(dá)。

結(jié)構(gòu)學(xué)預(yù)測是通過計算生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和同源模建等方法分析cVLP 的高級結(jié)構(gòu)。通過計算機輔助分析 cVLP 的抗體親和力，JOSHI 等［44］利用該方法在 HPV VLP 的EF 表面環(huán)成功表達(dá)了HBV preS1 抗原，證實其具有與天然HBV 親和強度相似的抗體。還有分子動力學(xué)模擬研究檢測分子間的相互作用（靜電作用和親、疏水特性）和結(jié)合能量的變化，預(yù)測cVLP 結(jié)構(gòu)的耐受性和穩(wěn)定性［45］。該方法已對在小鼠多瘤病毒VLP 上插入流感抗原后的嵌合情況進(jìn)行了分析，并將構(gòu)建好的cVLP 用非對稱流分離系統(tǒng)和差示掃描量熱法進(jìn)行驗證，結(jié)構(gòu)與預(yù)測相符［46］。

cVLP 疫苗的設(shè)計也給RSV 疫苗帶來了新的研究思路。RSV 是有包膜單股負(fù)鏈RNA 病毒，根據(jù)G 蛋白抗原特異性分為 A、B 兩個亞型。1966 年，RSV 甲醛滅活疫苗（FI-RSV）免疫 2 ～ 7 月齡嬰兒，RSV 疫苗引起再次感染，被稱為RSV 疫苗增強性疾病（ERD），目前尚無可準(zhǔn)確模擬人ERD 全部特征的動物模型，RSV 疫苗研究難點在于需保持免疫病理與免疫保護間的平衡，cVLP 疫苗可在有效靶點的研究基礎(chǔ)上，通過表位選擇，盡量規(guī)避引起免疫病理的區(qū)域位點。有研究通過RSV特有的結(jié)構(gòu)DS-cav1 找到RSV 有效的中和性抗原表位，通過結(jié)構(gòu)學(xué)測算設(shè)計構(gòu)建多種cVLP，之后再利用F 蛋白帕利珠單抗酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，高表達(dá)量及中和試驗等篩選出能誘導(dǎo)高滴度中和抗體的cVLP株，動物試驗具有較好的攻毒保護效力，且cVLP 免疫血清能產(chǎn)生相對均衡的IgG2a／IgG1 反應(yīng)，提示能誘導(dǎo)相對均衡的Th1／Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，cVLP 誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫以IFN-γ 分泌為主。

3.2 VLP 載體與免疫表位的連接方式

抗原表位或其他免疫刺激分子可通過化學(xué)或生物偶聯(lián)的方式，以及基因工程技術(shù)引入到載體特定區(qū)域或病毒外殼蛋白的表面。

化學(xué)或生物偶聯(lián)方式是通過化學(xué)修飾方式插入載體，這種化學(xué)修飾方式主要是針對20 種天然氨基酸中的5 種，即賴氨酸（氨基官能團）、谷氨酸和天冬氨酸（羧酸官能團）、半胱氨酸（巰基官能團）和酪氨酸（羥基官能團）。如賴氨酸殘基中含量較高的親核官能團可與異硫氰酸酯或 N -羥基丁二酰亞胺（NHS）發(fā)生酯化反應(yīng)。胺也可通過共價鍵連接到羧基上酰胺（肽）鍵，由羧酸選擇性偶聯(lián)，偶聯(lián)劑有碳二亞胺（EDC）。谷氨酸和天冬氨酸殘留物含有羧基，可使用EDC 修飾，與胺反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。半胱氨酸殘基中含有巰基，可與鹵乙?；蝰R來酰亞胺反應(yīng)。酪氨酸殘基含有酚羥基，可由重氮偶聯(lián)進(jìn)行修飾，這種修飾策略比上面列出的4 種反應(yīng)更復(fù)雜［47］。

基因工程技術(shù)是將外源抗原插入到病毒衣殼蛋白表面，形成和病毒衣殼蛋白的基因融合形成cVLP，主要有直接融合、linker 融合及蛋白overcoat 3 種研究策略。直接融合是將外源抗原直接插入至衣殼蛋白的N 端或C 端［48-49］，將外源抗原提呈至衣殼蛋白表面 loop 區(qū)［50］。雖然呈遞的抗原常是選擇能被B 細(xì)胞識別的天然抗原表面loop 區(qū)的表位，但內(nèi)部抗原在一些條件下更適合呈遞［51］。linker 融合是利用氨基酸短肽（如多個甘氨酸殘基）使外源抗原與衣殼蛋白相連接。每個衣殼蛋白單體一般具有堿性多肽域，如賴氨酸的—NH2，這些堿性多肽域朝向顆粒的外表面，短肽等小分子只要帶有合適的氨基酸基團，如—SH，可通過雙功能linker 結(jié)合并展示于VLP 表面，刺激機體產(chǎn)生抗體。蛋白overcoat 策略是利用手足口病毒（FMDV）2A 序列將外源抗原和衣殼蛋白序列相連接，在表達(dá)翻譯過程中可引起不一致的核糖體跳躍，實現(xiàn)天然衣殼蛋白和融合蛋白的共同表達(dá)，這種策略在當(dāng)插入序列較大時可使融合蛋白表達(dá)在每一個衣殼蛋白的顆粒表面［52］。

3.3 結(jié)構(gòu)確證研究

相比傳統(tǒng)疫苗，對重組cVLP 疫苗進(jìn)行全面結(jié)構(gòu)確證及質(zhì)量特性研究是保證產(chǎn)品質(zhì)量的重要方面，可參考基因工程重組產(chǎn)品的相關(guān)原則，對VLP 疫苗結(jié)構(gòu)及質(zhì)量特性的研究通常包括分子量（質(zhì)譜法、電泳法，并與理論值比較）、純度、肽圖分析、肽指紋圖譜分析、N 端 ／C 端測序、等電點、圓二色譜、三維構(gòu)象、中和表位研究、生物學(xué)活性等方面的檢測。由于cVLP 疫苗具備病毒樣顆粒的高級結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)確證也存在與常規(guī)重組產(chǎn)品較大的不同，需結(jié)合影響疫苗免疫原性的質(zhì)量特性，重視對VLP 的粒徑大小及結(jié)構(gòu)完整性的研究。通過電鏡及動態(tài)光散射等方法分析VLP 顆粒的大小、分布及形態(tài)，最終保證組裝的VLP 顆粒的完整性和粒徑的均一性。

另外，在采用不同表達(dá)系統(tǒng)時，需通過結(jié)構(gòu)確證研究對表達(dá)抗原翻譯后修飾進(jìn)一步解析，如N-端乙酰化、脫酰胺基、二硫鍵、糖化（glycation）、降解等，均需進(jìn)行相應(yīng)的確證研究。

4 結(jié)語

高效的中和免疫表位和展示載體的選擇是cVLP疫苗設(shè)計成功的關(guān)鍵，單個表位的潛能可能有限，最理想的設(shè)計應(yīng)是多表位的有機結(jié)合；表位與載體的適配性（包括長度范圍、嵌合位點等）也決定了形成cVLP 的結(jié)構(gòu)及免疫效果。在一些病理機制尚不清楚的難研性疫苗研究中，cVLP 疫苗能提供一個新的研究思路，但其成功還需結(jié)合載體、佐劑及組合免疫等綜合考慮。值得注意的是，并非所有病毒均可開發(fā)構(gòu)建成可自行組裝的VLP，作為cVLP 疫苗研發(fā)的遞呈載體。另外，從病毒結(jié)構(gòu)的本身及選擇目的基因出發(fā)到結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定性等，均會影響可組裝為VLP 結(jié)構(gòu)且具有良好免疫原性的VLP 疫苗載體的研發(fā)，這些均需充分研究和論證。