呂麗華， 朱麗娜， 王 皓， 楊文靜， 金安莉， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

細胞外囊泡是由細胞分泌的磷脂雙分子囊泡，外泌體是細胞外囊泡的一個重要分群，是直徑為40～100 nm的膜性囊泡狀小體[1]。外泌體是經(jīng)細胞的內吞運輸途徑形成的，在形成過程中會攜帶細胞來源的活性分子，如核酸、蛋白質、脂質等，可介導細胞之間的信號交流，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮重要作用[2-3]。外泌體的分離和鑒定對于研究其生物學功能及尋找疾病標志物是最基礎也是最關鍵的步驟。目前，外泌體的提取方法包括超速離心法、膜親和法、沉淀法、免疫磁珠法、超濾法、排阻色譜法等[4-5]。本研究擬選擇超速離心法、膜親和法、沉淀法提取并鑒定血漿外泌體，旨在了解及驗證不同方法提取血漿外泌體的效率。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取2018年12月—2019年2月復旦大學附屬中山醫(yī)院進行體檢的表面健康者8名，其中男4名、女4名，年齡21～36歲，所有對象體檢結果均在參考區(qū)間內。采集所有對象靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，1 000×g離心10 min，分離血漿，然后4 ℃ 13 000×g離心15 min，用0.22 μm濾器過濾，按1 mL/管分裝，置于-80 ℃凍存。本研究經(jīng)復旦大學附屬中山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

ExoQuick試劑盒（沉淀法）購自美國System Biosciences公司。exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit（膜親和法）購自美國QIAGEN公司。蛋白濃度測定試劑盒為Detergent Compatible Bradford Assay Kit，購自美國ThermoFisher Scientific公司。一抗抗體：CD63、TSG101購自美國Abcam公司，CD9購自美國CST公司；二抗抗體：辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體、羊抗兔IgG抗體購自上海碧云天公司。 N30納米流式檢測儀（廈門福流生物科技有限公司），Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位儀（英國Malvern公司），Tecnai Spirit G2 BioTWIN透射電子顯微鏡（簡稱透射電鏡，美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 血漿外泌體提取

取出凍存于-80 ℃的血漿，冰上融化，取1 mL，分別利用超速離心法、膜親和法和沉淀法提取血漿外泌體。

1.3.1 超速離心法 將1 mL血漿用36 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）稀釋，加入L-100XP超速離心機（SW32Ti轉子，美國貝克曼庫爾特公司）的超速離心管中，配平，4 ℃ 100 000×g離心2 h，將上清緩慢吸去，留取最后1 mL沉淀，渦旋震蕩混勻，吸取至SW41Ti轉子配套的離心管中，用6 mL PBS稀釋，裝滿離心管，配平，再次4 ℃ 100 000×g離心2 h，緩慢吸去上清，最終用100 μL PBS重懸沉淀。

1.3.2 沉淀法 按ExoQuick試劑盒說明書要求，吸取1 mL血漿，加入沉淀劑253 μL，吹吸混勻，4 ℃靜置30 min，1 500×g離心30 min，棄上清，管底沉淀用100 μL PBS重懸沉淀。

1.3.3 膜親和法 按照說明書要求，將Buffer XBP與過濾后的1 mL血漿樣本1∶1混勻后，轉移至分離柱中，500×g離心1 min，棄廢液；加入10 mL Buffer XWP至分離柱，5 000×g離心5 min；將分離柱轉移至新的收集管中，加入100 μL PBS至膜中央，室溫孵育5 min后，5 000×g離心5 min，所得樣本即為外泌體。

1.4 外泌體生物學特征鑒定與分析

1.4.1 外泌體的形態(tài) 取20 μL外泌體重懸液滴于電鏡專用銅網(wǎng)上，靜置3 min。隨后用2 %磷鎢酸溶液復染，室溫靜置5 min，用吸水濾紙吸干殘留的多余液體，在60 W白熾燈下靜置2～3 min，待樣本干燥后，置于透射電鏡下觀察形態(tài)。

1.4.2 外泌體的顆粒直徑 將已知直徑的熒光二氧化硅納米顆粒與外泌體樣本混合后，在N30納米流式檢測儀上選用波長為532 nm的激光器，檢測通道為散射通道和PE熒光通道，對樣本混合體系進行檢測。以系列二氧化硅納米顆粒的直徑及散射光強度繪制出標準工作曲線，對外泌體的折射率差異進行校正，將外泌體的散射光強度轉變?yōu)橹睆絽?shù)，并計算出外泌體的顆粒直徑。

1.4.3 外泌體動態(tài)光散射分析及Zeta電位測定 Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位儀利用動態(tài)光散射法原理分析樣本的粒徑分布情況，即體系中的顆粒因布朗運動而產生的散射光強度變化，檢測器將散射光信號轉化為電流信號，再通過數(shù)字相關器的運算得到顆粒在溶液中的擴散系數(shù)，最后計算出顆粒直徑大小及其分布。將制備的外泌體懸液用PBS稀釋，渦旋震蕩混勻，置于樣本池中。運用Zetasizer軟件分析不同方法提取的外泌體的直徑范圍及Zeta電位。

1.4.4 外泌體蛋白的鑒定分析 外泌體蛋白懸液采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進行定量檢測，隨后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS -PAGE），濕轉1.5 h，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，三羥甲基氨基甲烷-吐溫（trishydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）緩沖液洗滌，孵育一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌后加入相應二抗，室溫孵育1 h，隨后采用電化學發(fā)光法進行顯影。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對計量資料進行正態(tài)性分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，采用Welch's ANOVA對數(shù)據(jù)進行分析，事后檢驗采用兩樣本不等方差t檢驗[6]。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 透射電鏡鑒定3種方法提取的外泌體的形態(tài)

超速離心法、沉淀法和膜親和法提取的外泌體在透射電鏡下均能觀察到立體膜結構，呈現(xiàn)出茶托樣或凹半球樣，大小為40～100 nm，分散或聚集分布，但沉淀法混有較多的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和蛋白的聚沉物。見圖1。

2.2 外泌體的顆粒直徑

采用N30納米流式檢測儀檢測外泌體的顆粒直徑。超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的外泌體顆粒直徑分別為65.5（55.5～77.5）、73.5（61.5～101.5）、64.5（54.5～77.5）nm。親和法提取的外泌體直徑大于超速離心法和沉淀法（P＜0.05）。見圖2。

2.3 動態(tài)光散射法測定外泌體直徑及Zeta電位

動態(tài)光散射法測定超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的外泌體直徑分別為190.1（164.2～220.2）、295.3（220.2～396.1）、68.06（37.84～122.4）nm，大于N30納米流式儀的檢測結果。此外，3種方法提取的外泌體膜的Zeta電位均為負電荷，提示其均為膜結構。見圖3。

2.4 外泌體蛋白標志物的鑒定

免疫印跡法檢測結果表明，超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的血漿外泌體均表達外泌體蛋白標志物。見圖4。

2.5 外泌體提取效率評估及經(jīng)濟性比較

圖2 超速離心法、沉淀法和膜親和法提取的外泌體粒徑分布

圖3 動態(tài)光散射法檢測外泌體的粒徑及Zeta電位

圖4 免疫印跡法鑒定外泌體蛋白標志物

沉淀法提取的血漿外泌體蛋白總量和外泌體顆粒數(shù)均高于超速離心法和膜親和法（P＜0.05）。以外泌體顆粒數(shù)/蛋白總量比值表示外泌體的提取純度。超速離心法的提取純度高于膜親和法和沉淀法（P＜0.05）。超速離心法耗時且成本高，親和法耗時最少、成本中等，沉淀法成本最低。見圖5。

圖5 超速離心法、膜親和法、沉淀法提取外泌體的效率及經(jīng)濟性比較

3 討論

外泌體參與了細胞之間的信號交流，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，選擇合適的提取方法是研究外泌體的第一步。國際細胞外囊泡協(xié)會導則提出，鑒定樣本中存在細胞外囊泡的實驗要求至少包括：（1）使用電子顯微鏡等對樣本進行成像分析，證實膜泡結構；（2）通過納米級別的分析技術測定膜泡群體的粒徑情況；（3）使用免疫印跡法或流式等技術檢測囊泡的蛋白標志物[7]。

本研究采用超速離心法、膜親和法、沉淀法對血漿外泌體進行提取和鑒定。結果顯示，在透射電鏡下，外泌體均為茶托樣或凹半球樣立體膜結構。N30納米流式檢測儀的檢測結果顯示，膜親和法提取的外泌體直徑比超速離心法和沉淀法大。動態(tài)光散射法檢測結果提示3種方法提取的外泌體均為膜性結構。超速離心法提取的血漿外泌體純度最高，但最耗時、成本較高；膜親和法提取步驟耗時最少、成本中等；沉淀法提取的血漿外泌體蛋白質濃度和顆粒數(shù)量最高、成本最低，但提取的純度遠低于超速離心法。

采用透射電鏡觀察沉淀法提取的外泌體，提示有蛋白質和PEG聚合物污染，與文獻報道[9]相符。這些聚沉物對后續(xù)外泌體生物功能研究是否有影響值得商榷。也有學者使用沉淀法在細胞培養(yǎng)基中提取出背景干凈、形態(tài)典型的外泌體[9]，這可能與樣本自身、外泌體提取過程或電鏡樣本制備等有關。

本研究采用N30納米流式檢測儀和動態(tài)光散射法對外泌體進行單顆粒層面的分析，彌補了前者不能測定外泌體的Zeta電位及后者不能計算顆粒數(shù)的缺陷，3種方法得到的血漿外泌體大小與文獻報道[6，10]一致。雖然本研究動態(tài)光散射法測定外泌體的Zeta電位為負值，提示外泌體帶負電荷，可能為膜狀結構，但該方法測定的外泌體粒徑偏大。此外，該技術對外泌體的檢測不具有特異性，同時記錄了其他顆粒的信息。有研究結果顯示，動態(tài)光散射法對分布均一的單分散粒子群的檢測較準確，但不適合細胞外囊泡的群體檢測[11]。

超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的血漿外泌體均表達標志性蛋白。超速離心法和膜親和法提取的外泌體表達的蛋白純度較高，這是因為在提取過程中，血漿經(jīng)過至少2次高倍數(shù)的稀釋，已去除大部分血漿蛋白的污染，但不排除最后吸取樣本時仍有殘留蛋白。沉淀法提取的外泌體蛋白濃度最高，粒子數(shù)最多，這可能是因為助沉劑富集外泌體的同時會有大量其他囊泡或非囊泡組分與其發(fā)生共沉淀，造成結果假性增高，出現(xiàn)“高回收率、低特異性”的情況[11]。因此，通過顆粒數(shù)/蛋白總量比值評估外泌體提取效率時[12]，沉淀法的提取純度最低[13]。

綜上所述，超速離心法作為最經(jīng)典的方法，外泌體提取純度高，適合于體積大且外泌體量多的樣本，及于對外泌體純度要求嚴格的實驗?？紤]到超速離心離法耗時長，1次檢測的樣本數(shù)量少，因此不適用于臨床常規(guī)檢測。膜親和法操作簡便、耗時短，也可有效提取外泌體，適用于外泌體RNA的相關研究[8]。沉淀法提取的外泌體量大，但混入的雜質較多，不易分離出特異性外泌體。對于低豐度表達的外泌體分子，可采用多種提取方法聯(lián)合驗證，提高其檢出率。研發(fā)新的提取方法、改良或結合現(xiàn)有方法，使外泌體分離達到“高回收率、高特異性”是未來的研究方向，可為外泌體真正應用于臨床打下堅實的基礎。