梅一堃，譚鏡璁，王安君，王 慧，劉寧寧

上海交通大學公共衛(wèi)生學院，上海 200025

作為人體真菌微生物組的重要組成部分，白念珠菌是常見的條件性致病真菌之一，定植于大多數(shù)人體的胃腸道、生殖道、口腔和皮膚［1］。在具有健康免疫系統(tǒng)的個體中，白念珠菌通常是無害的，與局部微生物群的其他成員保持平衡。然而，宿主微生物群的改變（例如廣譜抗生素的應(yīng)用）、宿主免疫反應(yīng)的改變（例如在壓力、其他微生物感染或免疫抑制劑治療期間）或局部環(huán)境的變化（例如pH 值或營養(yǎng)成分的變化）可使白念珠菌過度生長并引起感染。這些感染包括淺表黏膜和皮膚感染，如鵝口瘡、陰道念珠菌感染、尿布疹以及血液感染（死亡率高達40%［2］）。白念珠菌感染引起的陰道炎癥狀被認為是源于宿主免疫反應(yīng)，而不是病原體介導的損傷［3］。宿主炎癥過程可由真菌細胞壁分子和蛋白質(zhì)觸發(fā)，它們與先天免疫細胞和上皮細胞的受體相互作用［4-5］。盡管真菌細胞壁成分具有公認的炎癥刺激能力，但研究者對在陰道感染等感染過程中可用于免疫識別的真菌細胞壁成分仍知之甚少。

真菌細胞壁是高度動態(tài)的復雜結(jié)構(gòu)，發(fā)揮維持細胞形狀和保護細胞的作用。細胞壁的堅固性是維持真菌形態(tài)的關(guān)鍵。白念珠菌細胞壁作為抵御外界侵害的第一道防線，是真菌和宿主之間的第一接觸點，因此細胞壁對于真菌-宿主相互作用和免疫識別至關(guān)重要，是抗真菌治療的潛在靶點。細胞壁由含有幾丁質(zhì)和β-葡聚糖（β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖）的內(nèi)骨架層和含有高糖化甘露糖蛋白的外層組成［6］。念珠菌細胞壁是真菌表面病原體相關(guān)分子模式 （pathogen-associated molecular pattern，PAMP） 和天然免疫細胞上病原體識別受體（pattern recognition receptors，PRR）之間分子相互作用的復雜基質(zhì)。PAMP-PRR 相互作用對識別真菌病原體和啟動適當?shù)拿庖叻磻?yīng)均至關(guān)重要［7］。本文綜述了白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)及其在宿主應(yīng)答過程中的作用，以期為抗真菌藥物研發(fā)提供新的研究線索和理論依據(jù)。

1 β-葡聚糖結(jié)構(gòu)特點與功能

1.1 結(jié)構(gòu)特點

β-葡聚糖是白念珠菌細胞壁主要成分，占細胞壁質(zhì)量的50%～60%；葡聚糖形成一個剛性骨架，維持細胞的形狀和物理強度［8］。

1.2 對白念珠菌壓力響應(yīng)的影響

β-葡聚糖重塑是白念珠菌菌絲生成的基礎(chǔ)。由pH 應(yīng)答基因1 （pH-responsive gene 1，Phr1） 編碼的蛋白PHR1p 在中性和堿性pH 條件下負責β-葡聚糖重塑。PHR1p 在菌絲細胞壁壓力響應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)中具有重要作用。Phr1缺失可改變?nèi)蚪M的表達譜，從而影響新陳代謝、物質(zhì)運輸、細胞周期、DNA 復制、轉(zhuǎn)錄和應(yīng)激反應(yīng)等多種功能和體內(nèi)平衡。此外，黃素載體2（flavin carrier 2，F(xiàn)lc2）編碼一種假定的鈣轉(zhuǎn)運蛋白，其在釀酒酵母中參與低張性休克時細胞內(nèi)鈣的釋放［9］；Flc2基因的缺失導致介導細胞壁完整性的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 通路過度激活，因此FLC2 對于維持細胞壁發(fā)揮了重要作用。在嚴重菌絲細胞壁壓力的情況下，幾丁質(zhì)合酶8（chitin synthase 8，CHS8）對白念珠菌在瓊脂平板上的生長也具有保護細胞壁完整性（cell wall integrity，CWI）的重要作用。

1.3 對白念珠菌宿主識別的影響

口腔角質(zhì)形成細胞是宿主抵御口腔念珠菌感染的第一道防線。真菌細胞壁成分與口腔角質(zhì)形成細胞的相互作用可調(diào)節(jié)宿主對念珠菌感染的應(yīng)激反應(yīng)。血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，Ho-1）是一種應(yīng)激誘導基因，其表達水平在熱滅活和活白念珠菌刺激的口腔角質(zhì)形成細胞中增加。白念珠菌感染后口腔上皮表層HO-1 的表達明顯高于健康口腔上皮。含β-葡聚糖的顆粒（β-glucancontaining particles，β-GPs）通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）/p38 MAPK/核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，NRF2）通路增加HO-1的表達［10］。此外，在熱滅活和侵襲口腔上皮的白念珠菌細胞壁表面均發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖。HO-1 可能在宿主防御白念珠菌感染引起的口腔上皮應(yīng)激中起重要作用。

低氧是感染生態(tài)位的一個主要特征，感染部位具有強烈免疫活性的區(qū)域。低氧對微生物和免疫細胞及其相互作用均有影響。牙囊為低氧區(qū)，牙周病的嚴重程度隨著白念珠菌的存在而增加［11］。 多形核白細胞（polymorphonuclear leucocyte，PMN）高度浸潤感染部位易形成小鼠真皮下膿腫的低氧環(huán)境。持續(xù)缺氧環(huán)境不影響PMN 的活性和代謝。然而，在缺氧條件下，白念珠菌感染干擾了特定的PMN 反應(yīng)。PMN 不能有效地吞噬細胞、產(chǎn)生ROS 或釋放細胞外DNA 陷阱（neutrophil extracellular traps，NET）。暴露于低氧水平時，β-葡聚糖對白念珠菌細胞壁的掩蔽導致宿主未能對白念珠菌侵入產(chǎn)生足夠的反應(yīng)，阻礙了樹突狀細胞（dendritic cell，DC） 相關(guān)性C 型植物血凝素（DC-associated type C phytohemagglutinin，dectin-1） 對PMN 表面的PAMP 傳感，導致真菌存活率提高。低氧條件下PMN 產(chǎn)生的乳酸增強了細胞壁掩蔽效應(yīng)［12］。因此，白念珠菌適應(yīng)機體缺氧環(huán)境也依賴于β-葡聚糖在細胞表面暴露減少。生長和氧化適應(yīng)蛋白1（growth and oxidant adaptation 1，Goa1）和攝入控制蛋白2（uptake control 2，Upc2）缺失導致的線粒體功能突變和超氧化物歧化酶1 （superoxide dismutase 1，Sod1）缺失，使得內(nèi)膜過氧化氫減少從而阻斷β-葡聚糖水平的降低。此外，β-葡聚糖的掩蔽作用通過提高乙醇氧化酶（alcohol oxidase I gene，Aox1）突變水平增強線粒體ROS 水平的積累。白念珠菌還可通過線粒體環(huán)單磷酸腺苷-蛋白激酶A （cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA）信號途徑誘導β-葡聚糖掩蔽，通過調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)、促進真菌定植而對缺氧生態(tài)位做出反應(yīng)。

1.4 對白念珠菌免疫識別的影響

Dectin-1 是一種髓樣表達的酪氨酸激酶偶聯(lián)受體，可以識別各種真菌表面的β-1,3-葡聚糖碳水化合物［13］。研究［14］表明，dectin-1 的Y238X 位點突變患者對白念珠菌黏膜感染高度敏感。然而，活的白念珠菌（包括酵母和菌絲形式），除了親本酵母細胞和成熟芽之間的區(qū)域，其他區(qū)域可在體外與dectin-1 高度特異性結(jié)合［15］。在感染早期，白念珠菌的β-1,3-葡聚糖被完全掩蓋［16］。通過逃避dectin-1 介導的免疫識別，β-1,3-葡聚糖的屏蔽有利于真菌存活［17］。研究［18］表明，通過藥物處理和關(guān)鍵基因缺失等方法可使白念珠菌β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖暴露，從而引起宿主對白念珠菌更強的免疫應(yīng)答。此外，決定白念珠菌胃腸道適應(yīng)度的關(guān)鍵因素是細胞表面β-葡聚糖的暴露水平，這也與宿主細胞上dectin-1 受體的信號傳遞強度有關(guān)。β-葡聚糖掩蔽和暴露的動態(tài)性質(zhì)被證明與形態(tài)發(fā)生有關(guān)，在全身感染期間發(fā)揮重要作用［19］。β-葡聚糖暴露對白念珠菌在其主要自然生態(tài)位（即哺乳動物胃腸道）定植的能力產(chǎn)生了較大的負面影響，因此β-葡聚糖是減少系統(tǒng)性念珠菌病患者真菌定植的潛在靶點。

1.5 對抗真菌藥物活性的影響

以細胞壁β-1,3-D-葡聚糖為靶點的新一代棘白菌素被證明是治療條件致病真菌如白念珠菌的有效藥物［20］。另外，Liu 等［21］通過對磷酸轉(zhuǎn)運受體PHO84 蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，PHO84 可以通過磷酸代謝影響多聚糖合成最終導致CWI受損；PHO84缺失可以降低β-葡聚糖合成酶和幾丁質(zhì)合酶（chitin synthase，CHS）的活性，最終降低白念珠菌細胞壁的合成量。磷酸鹽的攝入在真菌和人類細胞之間并不保守，人類也不會合成β-葡聚糖或幾丁質(zhì)。因此，同時抑制這些過程可以產(chǎn)生有效的抗真菌作用，且對人體毒性較低［21］，是一種切實可行、有效的抗真菌策略。

2 甘露聚糖結(jié)構(gòu)特點與功能

2.1 結(jié)構(gòu)特點

細胞壁的甘露聚糖部分占其干重的40%，其對于黏附、CWI、免疫識別十分重要［22］。N-甘露聚糖的核心結(jié)構(gòu)是由3個葡萄糖、9個甘露糖和2個N-乙酰葡萄糖胺殘基組成的聚焦磷酸二氫氯醇寡糖。外部支鏈甘露聚糖通過α-1,6-主鏈連接到N-甘露聚糖核。酵母細胞壁中有2 種主要的甘露糖結(jié)合蛋白，大多數(shù)是糖基磷脂酰肌醇修飾蛋白，它們通過α-1,6-葡聚糖共價連接到β-葡聚糖網(wǎng)絡(luò)。其他甘露糖結(jié)合蛋白具有內(nèi)部重復序列，通過堿敏感鍵與β-1,3-葡聚糖相連［23］。細胞壁蛋白通常通過O-鍵和N-鍵［24］進行甘露糖基化，包括結(jié)構(gòu)分子、細胞壁重塑酶、黏附素和促進致病性以及CWI的入侵相關(guān)蛋白［25］。

2.2 對白念珠菌免疫逃逸的影響

DC 通過C 型凝集素受體（C-type lectin receptor，CLR）、巨噬細胞甘露糖受體（macrophage mannose receptor，MMR）和DC 特異性細胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子（DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN）與白念珠菌細胞壁的甘露聚糖結(jié)合，是機體免疫識別的重要過程。有趣的是，雖然MMR能識別單端甘露糖殘基，DC-SIGN 可與更復雜的甘露糖殘基在特定構(gòu)象中相互作用，但同樣的甘露糖基化突變可阻礙DCSIGN 與念珠菌結(jié)合，從而使DC 解除隨后的吞噬作用。這表明盡管受體不同，但DC 對念珠菌的免疫感應(yīng)均需要N-連接的甘露寡糖。

甘露糖基轉(zhuǎn)移酶10 （mannosyltransferase 10，MNN10）是順式高爾基甘露聚糖聚合酶的一個重要亞基，被鑒定為α-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，負責非致病真菌如釀酒酵母和乳酸魯維酵母中甘露聚糖骨架的延伸［26］。細胞壁α-1,6-甘露糖骨架通過阻止宿主dectin-1介導的β-1,3-葡聚糖識別來維持白念珠菌的致病性。抑制白念珠菌α-1,6-甘露糖骨架的伸展，可以增強T 淋巴細胞介導的體內(nèi)免疫應(yīng)答［27］。甘露聚糖結(jié)構(gòu)改變導致葡聚糖暴露的表面密度和暴露面積增加。然而，白念珠菌細胞壁上的大多數(shù)葡聚糖暴露位點由多個葡聚糖結(jié)合位點組成［28］。這些更復雜的多聚結(jié)構(gòu)很可能在確定dectin-1 的多聚體和啟動念珠菌物種的先天免疫反應(yīng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［29］。

細胞壁O-甘露聚糖的丟失與吞噬體成熟標志物的獲得、p21 Ras小GTP酶（GTPase）超家族成員Rab-GTPase的顯著變化、巨噬細胞吞噬體內(nèi)菌絲的生長受損及巨噬細胞肌動蛋白動力學的變化密切相關(guān)，最終導致真菌細胞逃離巨噬細胞吞噬體的能力降低。細胞壁O-甘露聚糖的丟失導致細胞壁內(nèi)β-葡聚糖的暴露，促進dectin-1對細胞壁的識別，而dectin-1與吞噬體的成熟有關(guān)［30］。

2.3 對其他微生物定植的影響

戈登鏈球菌 （Streptococcus gordonii，S. gordonii）是一種普遍存在的口腔細菌，已被證明可與白念珠菌形成生物膜群落。白念珠菌生物膜群落的形成涉及白念珠菌菌絲表面S. gordoniiSspB 蛋白與凝集素樣序列3（agglutinin-like sequence，ALS3）蛋白的相互作用。研究［31］表明，早期的O-甘露糖基化對激活生物膜形成所需的菌絲黏附素功能、被S.gordonii等細菌識別和微生物群落發(fā)育至關(guān)重要。

3 幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)特點與功能

3.1 結(jié)構(gòu)特點

就生物量而言，幾丁質(zhì)是細胞壁中一類相對較小的組成部分（占1%～3%），但在所有已被研究的真菌物種中，幾丁質(zhì)對細胞活力的維持至關(guān)重要［32］。與β-葡聚糖網(wǎng)絡(luò)共價交聯(lián)的幾丁質(zhì)聚合物被認為有助于維持酵母細胞壁的剛性和物理強度［33］。幾丁質(zhì)含量降低失會導致細胞壁彈性增加，而其含量升高則會導致相反的結(jié)果［34］。細胞壁大分子之間的交聯(lián)是由位于細胞壁的碳水化合物活性細胞壁重塑酶催化的［35］。這些細胞壁重塑酶包括β細胞壁葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶家族（PHR1、PHR2、PGA4 和PGA5）［36］和幾丁質(zhì)-葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶家族（CRH11、CRH12 和UTR2）［37］，此外，白念珠菌含有一個由CHS1（Ⅱ類）、CHS2（Ⅰ類）、CHS3（Ⅳ類）和CHS8（Ⅰ類）組成的CHS基因家族。將β-半乳糖苷酶報告基因LacZ融合在每個CHS啟動子上，以檢測幾丁質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。每個CHS啟動子都有一個獨特的調(diào)控模式，對細胞壁損傷劑、特定CHS基因突變和外源Ca2+存在反應(yīng)。CHS基因表達和幾丁質(zhì)合成的調(diào)控由蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、高滲甘油反應(yīng)1 （high osmolarity glycerol response 1，HOG1）激酶和Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路協(xié)同完成。這些途徑的激活也導致體外CHS 活性增加和細胞壁幾丁質(zhì)含量升高［38］。

3.2 對白念珠菌適應(yīng)極端環(huán)境的影響

白念珠菌對極端pH 值環(huán)境的適應(yīng)也依賴于細胞壁重塑。酸性環(huán)境中，幾丁質(zhì)酶2（chitinase 2，CHT2）受B細胞抗原受體（B-cell receptor 1，BCR1）-鋅指轉(zhuǎn)錄因子RIM101 依賴性信號調(diào)控，表達降低；轉(zhuǎn)錄因子EFG1 為幾丁質(zhì)暴露的調(diào)節(jié)因子［39］，可導致幾丁質(zhì)長度改變，使細胞壁結(jié)構(gòu)重塑。這就解釋了在胃的酸性環(huán)境中，白念珠菌為何仍能生存。在陰道乳酸菌存在的酸性環(huán)境中，雖然白念珠菌生物膜形成被抑制，但白念珠菌細胞仍能定植生存［40］。

白念珠菌可以在42 ℃的環(huán)境下生存。熱應(yīng)激也可以激活白念珠菌的Mkc1（MAP kinase fromC.albicans）信號通路，導致幾丁質(zhì)含量升高，使得細胞壁更加堅固，這是由于在42 ℃時幾丁質(zhì)水平增加和對細胞壁損傷敏感性提高。熱處理的壓力響應(yīng)似乎與各種表面應(yīng)激壓力相似，導致Mkc1 信號被激活，某些修復相關(guān)的細胞壁蛋白增加，細胞分離酶減少，導致細胞壁與幾丁質(zhì)強化以及相關(guān)的細胞分離減少［41］。因此，幾丁質(zhì)對于白念珠菌在高溫環(huán)境下生存也有重要的意義。

3.3 對白念珠菌免疫逃逸的影響

Dectin-1 是一種模式識別受體，可以通過其胞質(zhì)信號結(jié)構(gòu)域介導多種細胞功能，包括吞噬、呼吸爆發(fā)和可溶性因子（如細胞因子、趨化因子和二十碳烯酸）的產(chǎn)生［42］。白念珠菌侵入人體后，人體巨噬細胞通過釋放一氧化氮來達到殺菌效果，而幾丁質(zhì)成分介導人巨噬細胞精氨酸酶-1 影響巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮，以保護自身存活。因此，幾丁質(zhì)酶抑制劑也是治療白念珠菌感染的有效藥物［43］。這對我們研究白念珠菌與免疫系統(tǒng)之間的相互作用提供了新的思路，對了解人類對白念珠菌的易感性和白念珠菌感染的治療具有重要意義。

4 白念珠菌中維持CWI的主要信號通路

CWI 相關(guān)主要信號通路負責維持剛性且動態(tài)的細胞壁，這對于菌絲生長、適應(yīng)環(huán)境挑戰(zhàn)以及宿主入侵和定植都很重要［44］。CWI 的功能依賴于外部傳感器的激活和MAPK 級聯(lián)的下游激活，后者反過來靶向作用于磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導參與細胞壁強化的不同蛋白質(zhì)的表達［45］。在白念珠菌中，已經(jīng)確定了3 種主要的MAPK 途徑，并確定了它們在真菌毒性和發(fā)病機制中的重要性［46］。PKC 途徑在細胞壁生物發(fā)生、應(yīng)激反應(yīng)和形態(tài)發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用，影響生物膜的形成和毒力［47］。高滲甘油反應(yīng)途徑主要參與應(yīng)激反應(yīng)和適應(yīng)，但也參與形態(tài)發(fā)生、毒力形成和細胞壁的生物發(fā)生［48-49］。CEK1 蛋白能對細胞壁抑制劑做出感應(yīng)而發(fā)生磷酸化反應(yīng)，其激活也受群體感應(yīng)和生長的調(diào)節(jié)。由于其在細胞壁生物發(fā)生中的重要性，CEK1介導的信號轉(zhuǎn)導途徑中關(guān)鍵因子的缺失將導致菌株細胞表面β-1,3-葡聚糖暴露程度升高，從而使與免疫受體dectin-1 結(jié)合的真菌細胞數(shù)量隨之增加，吞噬作用和巨噬細胞活化作用增強［50］。

5 展望

白念珠菌侵染人體主要引發(fā)口腔念珠菌病、胃腸道念珠菌感染以及陰道念珠菌病等。針對不同部位的感染特點，可以研發(fā)特異性的抗真菌感染策略防止白念珠菌定植，其中白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)組成成分是決定白念珠菌定植能力的重要因素。

白念珠菌細胞壁的甘露聚糖組分對于其黏附和免疫識別至關(guān)重要。細胞壁α-1,6-甘露糖骨架通過阻止宿主dectin-1 介導的β-1,3-葡聚糖的識別來維持白念珠菌的致病性。早期的O-甘露糖基化對激活生物膜形成所需的菌絲黏附素功能至關(guān)重要。幾丁質(zhì)不僅可影響細胞壁重塑，對于白念珠菌適應(yīng)極端pH 環(huán)境具有重要意義，還可使其避免受到人體免疫識別和巨噬細胞殺傷。此外，其對白念珠菌的熱應(yīng)激保護也有重要作用。

CWI 對于菌絲生長、適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激以及入侵和定植宿主都很重要。細胞壁生物合成的許多特征是真菌特有的，因此細胞壁被認為是抗真菌藥物開發(fā)的良好靶點。未來的研究可以結(jié)合細胞壁不同組分的特點建立體外模型，從而明確它們之間的作用關(guān)系，并篩選更多特異性抗真菌治療藥物，為開發(fā)細胞壁作為抗真菌藥物靶點提供良好的試驗工具。