劉振玲 李亞偉 楊涵越 劉曉飛 王傳洗

摘要 [目的]研究碳點（CDs）對作物種子萌發(fā)及生長的影響。[方法]采用微宇宙培養(yǎng)系統(tǒng)，探究10 mg/L下CDs處理對菠菜（伏播611）種子發(fā)芽性能及幼苗生長的影響。[結(jié)果]在菠菜種子培植10 d后，CDs處理的菠菜種子萌發(fā)率為69.0%，顯著高于對照組（46.0%，P<0.05）。CDs增加了菠菜幼苗的生物量，相對于對照組，鮮重提高30.1%，干重提高55.3%。CDs上調(diào)了菠菜種子的水通道蛋白基因表達，增加對水分的吸收，促進菠菜種子萌發(fā)及生長。[結(jié)論]CDs可以作為一種優(yōu)良的納米材料應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中，特別是應(yīng)用在作物種子的萌發(fā)及生長方面。

關(guān)鍵詞 碳點;菠菜種子;萌發(fā);幼苗生長;水通道蛋白基因

中圖分類號 Q945? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）24-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.001

Study on the Mechanism of Carbon Dots Promoting Crop Seed Germination and Growth

LIU Zhen-ling1，LI Ya-wei1，YANG Han-yue2 et al （1.Wuxi New Vision Environmental Protection Co.，Ltd.，Wuxi，Jiangsu 214135;2.Institute of Environmental Processes and Pollution Control，School of Environment and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122）

Abstract [Objective]To study the effects of carbon dots （CDs） on the germination and growth of crop seeds.[Method]A microcosmic culture system was used to explore the effects of CDs （10 mg/L） on the germination performance and seedling growth of spinach （Fubo 611）.[Result]After the spinach seeds were cultivated for 10 days，the seeds germination rate treated with CDs was 69.0%，which was significantly higher than that of the control group （46.0%，P<0.05）.CDs increased the biomass of spinach seedlings relative to the control group （fresh and dry weight increased by 30.1% and 55.3%，respectively）.CDs up-regulated the aquaporin gene expression of spinach seeds，increased water absorption，and promoted the germination and growth of spinach seeds.[Conclusion]CDs can be used as excellent nanomaterials for developing modern agriculture，especially in the germination and growth of crop seeds.

Key words Carbon dot;Spinach seed;Germination;Seedling growth;Aquaporin gene

基金項目 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（JUSRP221023）。

作者簡介 劉振玲（1981—），女，江蘇徐州人，高級工程師，碩士，從事環(huán)境評估和治理研究。*通信作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事環(huán)境功能材料研究。

收稿日期 2021-04-14

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，長期面臨著人多地少、資源短缺、糧食不足的壓力。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過多依賴資源消耗，農(nóng)業(yè)環(huán)境污染問題日益突出。因此，如何探索出一條高效、安全、資源節(jié)約、環(huán)境友好的可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展道路，是當(dāng)前必須應(yīng)對的重大挑戰(zhàn)。近年來，以人工納米材料（engineered nanomaterials，ENMs）生產(chǎn)的納米化肥、納米農(nóng)藥、納米農(nóng)業(yè)傳感器等新穎納米農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，在提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、降低資源投入、減少農(nóng)業(yè)環(huán)境污染等方面已經(jīng)顯現(xiàn)出巨大潛力[1-3]。已有研究表明，250? mg/kg CeO2 ENMs 在土壤中能夠抑制番茄鐮刀菌的生長，比對照組降低53%[4];100 mg/L CuO ENMs能夠提高水稻產(chǎn)量25%[5];500? mg/kg TiO2 ENMs 能夠增加麥粒中所有氨基酸的含量，而同等濃度下Fe2O3 ENMs只能增加半胱氨酸和酪氨酸的含量[6];0.8 mg/L Fe3O4 ENMs能夠促進草莓組培苗的生長并提高其對干旱脅迫的抗性[7];水培條件下50 mg/L的γ-Fe2O3 ENMs分別提高柚子幼苗葉綠素含量和根系活力23.2%和23.8%[8]。盡管這些金屬或金屬氧化物的ENMs可以有效調(diào)控作物產(chǎn)量及品質(zhì)，但農(nóng)業(yè)中的不當(dāng)使用或過度使用仍會損害生態(tài)系統(tǒng)并造成實質(zhì)性問題。

碳點（carbon dots，CDs）作為一類新興的碳基熒光ENMs，由于其表現(xiàn)出的優(yōu)良性能，如光吸收較寬、熒光可調(diào)、發(fā)光效率高、抗光漂白、化學(xué)穩(wěn)定性高、生物相容性好、低毒性等，被廣泛應(yīng)用于生物成像、藥物遞送、催化、光電器件等領(lǐng)域[9]。近年來，CDs被證實能夠促進作物生長，改善植物的光合作用，增強植物的抗性及固氮能力[10-11]。例如，0.02 mg/L 的CDs可以提高綠豆芽鮮重14.9%，促進光合產(chǎn)物碳水化合物的合成（21.9%）[10];0.1和100.0? mg/kg的碳黑材料可以增強大豆固氮作用（91%以上）[11]。前期研究表明石墨烯類ENMs具有豐富的含氧官能團，能夠增加水分的輸送，促進種子萌發(fā)[12]。

種子的萌發(fā)在植物生長周期過程中屬于一個極為關(guān)鍵的時期，也是對非生物環(huán)境因子極為敏感的階段。植物幼苗能否迅速健壯的生長與種子萌發(fā)能力密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，CDs在種子發(fā)芽階段發(fā)揮著重要的作用。CDs（0.56 mg/mL）顯著促進水稻種子的萌發(fā)[13];25%的CDs溶液可以在5 d時促進綠豆種子發(fā)芽[14]。然而CDs促進種子萌發(fā)的機制有待進一步研究。菠菜（Spinacia oleracea L.）富含豐富的胡蘿卜素、維生素C、氨基酸以及Fe、P、Na、K等礦質(zhì)元素，是我國食用的重要綠葉蔬菜之一[15]。因此，該研究選取菠菜作為供試作物，揭示CDs促進種子萌發(fā)及生長的機制，以期為CDs在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 該試驗于江南大學(xué)環(huán)境過程與污染控制研究所進行。供試菠菜種子（伏播611）購于河北大禹種業(yè)有限公司。CDs合成原料檸檬酸購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，尿素購自上海泰坦科技股份有限公司。試驗所用去離子水為實驗室自制。試驗用土為潮土，土壤基本理化性質(zhì)為pH 7.5、有機質(zhì)20 mg/kg。

該試驗所用CDs為自制：取檸檬酸1.0 g和尿素0.5 g，溶解于40 mL純水中，裝入50 mL高壓反應(yīng)釜中，在180 ℃的烘箱中反應(yīng)10 h后，經(jīng)過濾，收集溶液，隨后將所收集的溶液通過真空冷凍干燥機（中國上海比朗FD-1A-50）干燥得到樣品[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 CDs懸浮液的制備。

從制備的CDs樣品中稱取一定量加入純水中，將溶液在20 ℃下利用超聲波細胞粉碎機（新芝SCIENTZ-IID）進行超聲處理（200 W，20 kHz）10 min，使其均勻分散于水中形成納米材料懸浮液，最終制備出濃度為10 mg/L 的CDs懸浮液。

1.2.2 CDs性質(zhì)的表征。

通過透射式電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社JEM-2100）觀察CDs形態(tài)與粒徑分布，利用X射線光電子能譜（XPS，美國賽默飛ESCALAB 250Xi）和傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀（FTIR，德國布魯克TENSOR 27）測定CDs表面的主要官能團種類及其元素組成。

1.2.3 菠菜發(fā)芽試驗。

選取直徑5 cm、鋪有1層定性濾紙的塑料培養(yǎng)皿，挑選大小均勻飽滿的42粒菠菜種子（伏播611），用0.05%的次氯酸鈉溶液浸泡 30 min 以除去表面細菌，再用去離子水多次沖洗后培育于培養(yǎng)皿，均勻排布。將純水和處理濃度為10 mg/L的CDs溶液分別噴施于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿用封口膜密封后于25 ℃下避光培養(yǎng)。

選取長54 cm、寬28 cm，共50穴的育苗穴盤，其中12個穴位鋪滿土壤。試驗設(shè)計3個處理，分別為空白（CK）以及2個碳點（CDs1和CDs2）處理，每個處理4個穴位，挑選大小均勻的108粒菠菜種子（伏播611），用0.05%的次氯酸鈉溶液浸泡 30 min 以除去表面細菌，再用去離子水多次沖洗后培育于育苗穴盤中，每個穴位播種9粒種子，均勻排布。將純水和處理濃度為10 mg/L的CDs1和CDs2溶液分別噴施于育苗穴盤中，將育苗穴盤放于25 ℃下避光培養(yǎng)。

1.3 測定方法

1.3.1 發(fā)芽率。試驗測試期間每日記錄菠菜種子的發(fā)芽數(shù)，試驗結(jié)束后計算菠菜種子的發(fā)芽率，計算公式為：發(fā)芽率=（發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)）× 100%。

在試驗測試期間種子幼根或子葉伸出種皮視為萌發(fā)，只有幼根超過1 mm才被記為根長。

1.3.2 生物量。

在發(fā)芽試驗結(jié)束后，收集菠菜幼苗，利用電子天平測定其鮮重，通過烘箱干燥后，測定其干重。

1.3.3 根參數(shù)。

在發(fā)芽試驗結(jié)束后，收集菠菜幼苗，利用掃描儀（Scanner，日本愛普生12000XL）測定菠菜幼苗的長度和表面積。

1.3.4 水通道蛋白表達量測定。

選定2條PIPs基因特異性引物進行熒光定量PCR分析[17]。在對菠菜進行發(fā)芽處理5 d以后，用液氮快速冷凍菠菜幼苗，并仔細研磨至呈粉末。采用通用植物總RNA提取試劑盒（Takara，Japan）提取菠菜幼苗的總RNA。提取的RNA用超微量分光光度計測定樣品的純度和濃度，檢驗合格的RNA進行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗。隨

后用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，Japan）將符合要求的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用OriginPro 2016 SR0程序進行分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對空白和處理組的平均值進行比較，分析結(jié)果進行Tukey-Kramer檢驗，P<0.05時，試驗結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDs ENMs的表征

試驗用的CDs ENMs采用一步水熱法制備[16]，其結(jié)構(gòu)、尺寸、表面化學(xué)性質(zhì)由電子透射顯微鏡（TEM）、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜（FTIR）和X射線光電子能譜（XPS）進行表征。從TEM照片（圖1）可以看出，CDs尺寸分布均在10 nm以下，平均尺寸為（5.5±0.3）nm，呈規(guī)則圓形顆粒狀。FTIR結(jié)果證實CDs的主要官能團包括—OH、

CO、CC

等（圖2）。由XPS結(jié)果（圖3）可知，CDs的主要元素組成是C、N、O，并且有吡啶氮、吡咯氮、石墨氮等結(jié)構(gòu)存在。高分辨XPS結(jié)果（圖4）表明，CDs ENMs表面具有多種親水官能團，與FTIR結(jié)果非常一致。這些官能團賦予了CDs優(yōu)異的水相分散性。據(jù)報道，含有sp2和sp3混合結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯，可以作為優(yōu)良的水分傳遞劑，增加土壤保水作用，從而促進種子萌發(fā)[12]。因此，擁有相似結(jié)構(gòu)的CDs ENMs可能也有類似的水分傳遞作用。

2.2 CDs ENMs在水環(huán)境中對菠菜種子發(fā)芽及生長的影響

從圖5可以看出，CDs ENMs（CDs1）能夠顯著促進菠菜種子的萌發(fā)。從第4天至第10天，施加CDs1的菠菜種子的發(fā)芽率均明顯高于對照組;在第10天時，施以CDs1的菠菜種子發(fā)芽率為69.0%，而對照組為46.0%，比較對照組，CDs1處理使得發(fā)芽率提高50.0%（圖6）。除此之外，CDs1也顯著增加了菠菜干鮮重，相比于對照，鮮重增加了30.1%，干重增加了55.3%（圖7a）。同時，CDs1對于菠菜根、莖形態(tài)的發(fā)育均有促進作用，主要體現(xiàn)在莖長和表面積方面（圖7b、圖7c和圖8）。CDs1能夠增加菠菜種子的長度，地上部增加43.4%，根部增加69.4%（圖7b）。CDs1能夠增加菠菜根、莖的表面積，根表面積增加44.8%，莖表面積增加38.7%（圖7c）。由此可見，CDs ENMs在水環(huán)境中不僅可以提高種子的萌發(fā)率，而且能夠提高幼苗的生物量。

2.3 CDs ENMs在土壤中對菠菜種子發(fā)芽及生長的影響

種子萌發(fā)往往在土壤中進行，促進種子在土壤中發(fā)芽及生長更具有農(nóng)業(yè)操作價值。為了驗證在土壤中CDs ENMs（CDs1）對菠菜種子發(fā)芽的影響，該研究設(shè)計了土施試驗，結(jié)果表明（圖9～10），土壤培育19 d，CDs1能夠顯著促進對菠菜種子發(fā)芽，其發(fā)芽率及生長遠遠高于對照組。同時，該研究采用另外一種結(jié)構(gòu)相似的CDs ENMs（CDs2），進行施用作為另一個處理組。由圖9可知，施用CDs2的菠菜種子的萌發(fā)率及生長也高于對照組。此結(jié)果說明在土壤培植菠菜時，施用CDs可以很好地促進菠菜種子發(fā)芽及生長。

2.4 CDs ENMs促進菠菜種子萌發(fā)的機制研究

水分在種子發(fā)芽中起著至關(guān)重要的作用。在發(fā)芽開始時，種子中的水溶物質(zhì)開始吸收水分;而當(dāng)胚胎開始發(fā)育時，種子繼續(xù)需要吸收大量水分。為了探究CDs對菠菜種子吸水能力的影響，該研究測定了控制水分吸收的水通道蛋白的調(diào)控基因。PIPs基因表達結(jié)果表明，經(jīng)CDs處理的菠菜種子相比于對照組，其水通道蛋白基因表達量顯著增加（圖11）。對于

菠菜水通道蛋白調(diào)控基因的2種基因（SoPIP1;2和SoPIP2;1）而言，CDs處理組基因表達量分別顯著提高409.0%、156.0%（圖11）。施加CDs的菠菜幼苗含水率顯著高于對照組，這與水通道蛋白基因表達的結(jié)果相吻合。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)硅量子點（0.01～0.30 mg/mL）可以提高黃瓜幼苗根部的水通道蛋白基因表達，從而促進幼苗生長。因此，該研究結(jié)果表明CDs可以通過上調(diào)菠菜水通道蛋白基因的表達，從而提高種子的吸水能力，促進種子發(fā)芽（圖12）。另外由于CDs自身的特定結(jié)構(gòu)（—OH和—CO等表面官能團）使其可以作為優(yōu)良的土壤保濕劑，保證種子發(fā)芽所需要的濕度，進而促進種子發(fā)芽（圖12）。

3 討論與結(jié)論

基于ENMs，發(fā)展新型的納米農(nóng)業(yè)技術(shù)及產(chǎn)品（納米肥料和納米農(nóng)藥）能夠減少現(xiàn)有農(nóng)業(yè)化學(xué)品投入，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的影響。同時，納米農(nóng)業(yè)技術(shù)有效地保持/提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，利于保證全球糧食安全，降低人口快速增加對糧食需求的壓力[19]。截至目前，基于金屬和金屬氧化物的納米農(nóng)業(yè)技術(shù)得到快速發(fā)展。例如，氧化銅納米片（50 mg/L）可以提高大豆地上生物量（60.3%）和地下生物量（34.3%）[20];3% Fe2O3 ENMs提高了36.5% 的生菜幼苗干重[21]。然而，金屬和金屬氧化物在農(nóng)業(yè)中不適當(dāng)或過量使用，使得這些納米肥料會通過許多途徑進入土壤，進行植物積累，最終進入食物鏈，對人體造成危害[22]。

相比之下，CDs ENMs具有生物相容性、化學(xué)惰性，甚至對食物鏈和人體細胞無毒。近年來的研究表明，CDs可以作為光轉(zhuǎn)換材料，提高作物對光的捕獲能力，從而增強其光合作用，提高作物產(chǎn)量。例如，煙草葉片在注射CDs 溶液2 d后，其光合速率提升了18.0%[23];CDs（560 mg/L）可以增強光合中Rubisco活性（42.0%），并使雙子葉谷物（大豆、番茄和茄子）的產(chǎn)量提高20.0%[24]。該研究結(jié)果表明，由一步水熱法合成的粒徑小于10 nm的CDs ENMs自身獨特的親水結(jié)構(gòu)以及上調(diào)種子水通道蛋白表達，可以增強種子吸水能力，從而能夠促進作物種子的發(fā)芽和生長，這為后期的作物生長及產(chǎn)量提供了重要的保障。除此之外，不同CDs均對種子萌發(fā)有顯著的促進作用，同時CDs具有低毒性、來源廣泛、成本低的特點，使其在納米農(nóng)業(yè)發(fā)展上有廣闊應(yīng)用前景。因此，基于CDs ENMs的納米農(nóng)業(yè)技術(shù)有望應(yīng)用在可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。然而，目前CDs ENMs的大規(guī)模合成的局限性和高成本阻礙了其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的廢棄生物質(zhì)提供了多種廉價的前體物質(zhì)，開發(fā)生物質(zhì)資源化利用技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)生物質(zhì)CDs ENMs的大量、廉價制備。因此，生物質(zhì)CDs ENMs在未來的農(nóng)業(yè)中具有巨大的潛力。

參考文獻

[1] ADISA I O，PULLAGURALA V L R，PERALTA-VIDEA J R，et al.Recent advances in nano-enabled fertilizers and pesticides：A critical review of mechanisms of action[J].Environmental science：Nano，2019，6（7）：2002-2030.

[2] GIRALDO J P，WU H H，NEWKIRK G M，et al.Nanobiotechnology approaches for engineering smart plant sensors[J].Nature nanotechnology，2019，14（6）：541-553.

[3] KAH M，KOOKANA R S，GOGOS A，et al.A critical evaluation of nanopesticides and nanofertilizers against their conventional analogues[J].Nature nanotechnology，2018，13（8）：677-684.

[4] ADISA I O，REDDY PULLAGURALA V L，RAWAT S，et al.Role of cerium compounds in Fusarium wilt suppression and growth enhancement in tomato （Solanum lycopersicum）[J].Journal of agricultural and food chemistry，2018，66（24）：5959-5970.

[5] LIU J，SIMMS M，SONG S，et al.Physiological effects of copper oxide nanoparticles and arsenic on the growth and life cycle of rice （Oryza sativa japonica ‘Koshihikari’） [J].Environmental science & technology，2018，52（23）：13728-13737.

[6] WANG Y Y，JIANG F P，MA C X，et al.Effect of metal oxide nanoparticles on amino acids in wheat grains （Triticum aestivum） in a life cycle study[J].Journal of environmental management，2019，241：319-327.

[7] MOZAFARI A A，HAVAS F，GHADERI N.Application of iron nanoparticles and salicylic acid in in vitro culture of strawberries （Fragaria × ananassa Duch.） to cope with drought stress[J].Plant cell tissue & organ culture，2018，132（3）：511-523.

[8] HU J，GUO H Y，LI J L，et al.Comparative impacts of iron oxide nanoparticles and ferric ions on the growth of Citrus maxima[J].Environmental pollution，2017，221：199-208.

[9] LIU J J，LI R，YANG B.Carbon dots：A new type of carbon-based nanomaterial with wide applications[J].ACS central science，2020，6（12）：2179-2195.

[10] WANG H B，ZHANG M L，SONG Y X，et al.Carbon dots promote the growth and photosynthesis of mung bean sprouts[J].Carbon，2018，136：94-102.

[11] WANG Y，CHANG C H，JI Z X，et al.Agglomeration determines effects of carbonaceous nanomaterials on soybean nodulation，dinitrogen fixation potential，and growth in soil[J].ACS nano，2017，11（6）：5753-5765.

[12] HE Y，HU R，ZHONG Y，et al.Graphene oxide as a water transporter promoting germination of plants in soil[J].Nano research，2018，4：1928-1937.

[13] LI H，HUANG J，LU F，et al.Impacts of carbon dots on rice plants：Boosting the growth and improving the disease resistance[J].ACS applied bio materials，2018，1（3）：663-672.

[14] SANKARANARAYANAN S，VISHNUKUMAR P，HARIRAM M，et al.Hydrothermal synthesis，characterization and seed germination effects of green-emitting graphene oxide-carbon dot composite using brown macroalgal bio-oil as precursor[J].Journal of chemical technology & biotechnology，2019，94（10）：3269-3275.

[15] 黃碧陽.光質(zhì)與光周期環(huán)境對菠菜生長發(fā)育的影響[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2018.

[16] 曹中濤.碳量子點的制備及其在有機發(fā)光二極管中的應(yīng)用研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2017.

[17] CHEN K，F(xiàn)ESSEHAIE A，ARORA R.Aquaporin expression during seed osmopriming and post-priming germination in spinach[J].Biologia plantarum，2013，57（1）：193-198.

[18] LI Y J，LI W，ZHANG H R，et al.Biomimetic preparation of silicon quantum dots and their phytophysiology effect on cucumber seedlings[J].Journal of materials chemistry B，2019，7（7）：1107-1115.

[19] LOWRY G V，AVELLAN A，GILBERTSON L M.Opportunities and challenges for nanotechnology in the agri-tech revolution[J].Nature nanotechnology，2019，14（6）：517-522.

[20] MA C X，BORGATTA J，HUDSON B G，et al.Advanced material modulation of nutritional and phytohormone status alleviates damage from soybean sudden death syndrome[J].Nature nanotechnology，2020，15（12）：1033-1042.

[21] JURKOW R，SE‘KARA A，POKLUDA R，et al.Biochemical response of oakleaf lettuce seedlings to different concentrations of some metal（oid） oxide nanoparticles[J].Agronomy，2020，10：997-1015.

[22] 林茂宏，沈玫玫，吳佳妮，等.納米氧化鋅對兩種蔬菜種子發(fā)芽及幼苗生長的影響[J].農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報，2021，38（1）：72-78.

[23] SAI L M，LIU S Q，QIAN X X，et al.Nontoxic fluorescent carbon nanodot serving as a light conversion material in plant for UV light utilization[J].Colloids & surfaces B：Biointerfaces，2018，169：422-428.

[24] LI H，HUANG J，LIU Y，et al.Enhanced RuBisCO activity and promoted dicotyledons growth with degradable carbon dots[J].Nano research，2019，12（7）：1585-1593.