吳夢(mèng)詩(shī)，羅欣

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 產(chǎn)科，重慶 400000)

0 引言

胎兒染色體異常(例如染色體非整倍性和染色體節(jié)段失衡)在妊娠中很常見，并且通常發(fā)生在植入前的胚胎期，由減數(shù)分裂分離錯(cuò)誤或有絲分裂復(fù)制錯(cuò)誤引起[1]。通常，它們會(huì)導(dǎo)致孕早期胚胎生長(zhǎng)停滯，植入失敗或早期流產(chǎn)。但是，有1%-1.7%的胎兒仍具有發(fā)育能力，如果無法通過產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)，胎兒則可以持續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育到孕中期及孕晚期，它們會(huì)受到染色體異常的影響，并在出生時(shí)表現(xiàn)為染色體疾病綜合征。在1歲之前診斷出的主要先天性異常中，大約15%是由染色體異常引起的，其中25%將導(dǎo)致圍產(chǎn)期死亡[2]。對(duì)于存活的染色體異常的孩子，也很大可能伴隨智力低下，多發(fā)性發(fā)育不良或畸形。但是，到目前為止，對(duì)此尚無有效的治療措施。因此，在出生前檢測(cè)染色體疾病則尤為重要。許多國(guó)家為未出生的胎兒提供篩查計(jì)劃(產(chǎn)前檢測(cè)及診斷)，以識(shí)別某些有相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，幫助其早期診斷和治療。隨著技術(shù)的進(jìn)步同時(shí)也刺激了產(chǎn)前篩查計(jì)劃的發(fā)展，最初，常規(guī)的唐氏綜合征篩查僅在孕中期進(jìn)行，僅使用甲胎蛋白(AFP)進(jìn)行篩查，隨后擴(kuò)大到包括全部或游離的β人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)，未結(jié)合的三聚雌三醇和二聚抑制素A。到90年代末，使用超聲影像學(xué)在孕期第三個(gè)月(例如頸部半透明層，鼻骨)和生化標(biāo)志物，游離β-hCG和妊娠相關(guān)血漿蛋白A進(jìn)行產(chǎn)前篩查也逐漸開展[3]。1997年，通過鑒定Y染色體特異性DNA片段，在孕婦血漿和血清樣品中首次發(fā)現(xiàn)了無細(xì)胞胎兒DNA(cffDNA)[4]。發(fā)展至今，cffDNA作為一種有前途的分子生物標(biāo)志物，其發(fā)現(xiàn)使產(chǎn)前檢測(cè)發(fā)生了巨大轉(zhuǎn)變，也已被用于產(chǎn)科研究的各個(gè)方面，尤其在產(chǎn)前診斷和復(fù)雜妊娠中，可以更安全、更早地檢測(cè)到胎兒的遺傳狀況。胎兒染色體非整倍性的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)為孕早期產(chǎn)前篩查提供了另一種高效的方法，并且自發(fā)現(xiàn)之日起便在世界范圍內(nèi)迅速采用。隨著無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)的廣泛采用，許多通過傳統(tǒng)篩查方法歸為高?；虻臀Ｈ焉锏脑袐D也開始選擇NIPT，這種選擇已經(jīng)使侵入性診斷的需求降低高達(dá)40%[5]。目前商業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)擴(kuò)大了cffDNA篩選的范圍，包括性染色體非整倍性，罕見的常染色體非整倍體和亞顯微拷貝數(shù)變異，且已經(jīng)以“ NIPTplus”的形式開展檢測(cè)。

1 cffDNA介紹

在懷孕期間，可以在母體血漿中檢測(cè)到來自發(fā)育中的胎兒的DNA，并將其稱為無細(xì)胞胎兒DNA(cffDNA)，cffDNA起源于胎盤的滋養(yǎng)層，并由核酸內(nèi)切酶降解后作為短dsDNA片段釋放到母體血中，長(zhǎng)度為143bp，因此，cffDNA平均比母體無細(xì)胞DNA(cfDNA)短，后者的中位長(zhǎng)度為166bp，它來源于身體多種組織細(xì)胞的自然裂解，其中大部分來自造血細(xì)胞。因此，孕婦血漿中的cfDNA是母體cfDNA和從胎盤釋放的無細(xì)胞胎兒DNA(cffDNA)的混合物，可用于測(cè)試胎兒的遺傳狀況[6]。通常在妊娠6至7周時(shí)可檢測(cè)到cffDNA，據(jù)報(bào)道最早的檢測(cè)是在4～5周時(shí)檢測(cè)到的[7]。cffDNA與總cfDNA的比例稱為胎兒分?jǐn)?shù)，在整個(gè)懷孕期間都會(huì)增加，在妊娠晚期可能高達(dá)30%。胎兒分?jǐn)?shù)隨母體BMI升高而降低，產(chǎn)婦年齡也與胎兒分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)[8]。胎兒出生并娩出胎盤后，cffDNA會(huì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)從母體循環(huán)中清除。自cffDNA發(fā)現(xiàn)以來，其徹底改變了產(chǎn)前基因檢測(cè)，從而允許開發(fā)用于非整倍體的非侵入性篩查方法，稱為非侵入性產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)或非侵入性產(chǎn)前篩查(NIPS)，以及針對(duì)單基因疾病的診斷檢測(cè)，稱為非侵入性產(chǎn)前診斷(NIPD)。染色體微陣列分析(CMA)，可檢測(cè)染色體的亞顯微拷貝數(shù)變化，被推薦為胎兒的一種或多種先天染色體異常檢測(cè)的一線測(cè)試[9]。而迅速發(fā)展的下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)為產(chǎn)前診斷帶來了革命性的變化，使全基因組測(cè)序更快，更經(jīng)濟(jì)。通過比較拷貝數(shù)變異，NGS已顯示出與CMA相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性，NIPT是NGS技術(shù)的一個(gè)里程碑，當(dāng)用于檢測(cè)母體血液中的無細(xì)胞胎兒DNA(cffDNA)時(shí)，為21三體性和其他非整倍性的胎兒診斷提供了卓越的準(zhǔn)確性[10]。

2 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)目前優(yōu)點(diǎn)

多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)了NIPT的檢出率及有效性，先前報(bào)道指出NIPT對(duì)21三體的敏感性為99.7%，而18三體性為97.9%，13三體性為99.0%[11]。NIPT對(duì)13三體和18三體的敏感性較低，是由于這些染色體的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的平均含量低于21號(hào)染色體，這在測(cè)序反應(yīng)中引入了不均勻的偏倚。因此，NIPT相對(duì)于孕中期的生化篩查具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，比孕前生化篩查和頸部半透明性測(cè)量有更高的特異性和敏感性。而且因?yàn)樗募訇?yáng)性率較低，這也意味著在健康的妊娠中減少了許多不必要的侵入性檢查[12]。侵入性產(chǎn)前診斷的并發(fā)癥包括但不限于流產(chǎn)及感染等，在臨床實(shí)踐中，處于染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦由于擔(dān)心上述風(fēng)險(xiǎn)而經(jīng)常拒絕進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷。因此，愿意接受NIPT的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦人數(shù)也逐漸增加。從終止妊娠的時(shí)機(jī)上來說，NIPT可以從妊娠第9周開始進(jìn)行，讓獲得陽(yáng)性結(jié)果的婦女在數(shù)周內(nèi)就是否終止妊娠能夠做出決定。相比之下，羊膜腔穿刺術(shù)從第15周開始進(jìn)行，導(dǎo)致終止妊娠的程序更加復(fù)雜，也將給孕婦帶來更不利的心理和生理影響。加之侵入性產(chǎn)前診斷的開展需要較高的技術(shù)要求和實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，因此該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用也受到局限[13]。NIPT的開發(fā)最初目的主要是檢測(cè)T21，T18和T13，這是產(chǎn)前篩查和診斷的重點(diǎn)。但是，技術(shù)的進(jìn)步使胎兒其他疾病的檢測(cè)也成為可能，這對(duì)于預(yù)防先天缺陷是必不可少的。通過應(yīng)用與染色體非整倍性分析相同的原理，NIPT也已擴(kuò)展到檢測(cè)胎兒基因組內(nèi)的染色體缺失和重復(fù)，即應(yīng)用NIPT-Plus進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)前檢測(cè)。

3 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)目前局限性

近年來，NIPT因其對(duì)T21，T18，T13和某些性染色體疾病具有很高的檢測(cè)率，已經(jīng)改變了產(chǎn)前篩查和診斷。但是，盡管其具有高準(zhǔn)確性，NIPT也有一些局限性。它對(duì)T21，T18和T13的檢測(cè)具有>90%的靈敏度和較低的假陽(yáng)性率。對(duì)于常見的胎兒非整倍體和性染色體異常(SCA)，其假陽(yáng)性率分別為0.09%和1%。假陽(yáng)性病例最常見的是母親的染色體拷貝數(shù)變異(48%)，其次是局限性胎盤鑲嵌(32%)和母親患癌癥(15%)[14]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，估計(jì)約有2%-10%的具有頸部透明性異常的胎兒會(huì)被NIPT遺漏，以及一定比例的染色體結(jié)構(gòu)重排，鑲嵌，三倍體和基因拷貝數(shù)變異。這很可能是由于胎兒cffDNA從母體血漿和MPS擴(kuò)增而來，導(dǎo)致胎兒和母體DNA混合和部分降解。因此cfDNA測(cè)試不能代替早期超聲和血清標(biāo)志物評(píng)估，因?yàn)檫@些技術(shù)可以識(shí)別其他高危胎兒狀況，例如無腦兒[15]。羊膜腔穿刺術(shù)最常用于中孕期快速核型分析，并被認(rèn)為是在染色體異常高危妊娠中診斷胎兒染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NIPT可能會(huì)錯(cuò)過通過羊膜穿刺術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)所發(fā)現(xiàn)的染色體異常的30.0%。由于NIPT-plus的發(fā)展，該比例將來可能會(huì)降低。因此，不建議將NIPT作為具有超聲軟標(biāo)記或病理超聲檢查結(jié)果的妊娠的染色體畸變的一線篩查方法，但NIPT可以被認(rèn)為是對(duì)有腹腔穿刺禁忌證或擔(dān)心與手術(shù)相關(guān)的胎兒流產(chǎn)的妊娠的可接受的替代方法[16]。

4 NIPT-plus的發(fā)展前景

基于cfDNA分析的非侵入性產(chǎn)前檢查已改變了產(chǎn)前保健。以適當(dāng)?shù)馁M(fèi)用進(jìn)行NIPT是在一般妊娠人群中對(duì)常見胎兒三體性進(jìn)行經(jīng)濟(jì)高效高靈敏的一線篩查策略。與常規(guī)篩查相比，NIPT初級(jí)篩查提高了三體檢查的整體檢出率，并提供了更有效的介入式檢查參考，從而減少了進(jìn)行侵入性產(chǎn)前檢查的次數(shù)與手術(shù)相關(guān)的流產(chǎn)和其他與手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥。NIPT能夠檢測(cè)T21/T18/T13和幾種性染色體疾病，但不能檢測(cè)結(jié)構(gòu)異常，鑲嵌，微缺失或微重復(fù)。NIPT無法檢測(cè)到任何大小小于2Mb的染色體失衡，這可能反映了它對(duì)深度序列或讀取低濃度母體血液cff-DNA模板的局限性[17]。這些不可檢測(cè)的異常大多數(shù)不是致命性的，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，會(huì)通過增加不孕和流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)來影響生殖健康。最近，NIPT的進(jìn)一步發(fā)展集中在對(duì)由節(jié)段染色體失衡引起的微缺失/微重復(fù)綜合征(MMS)的附加分析上。盡管MMS相對(duì)少見，但它們共同代表了很大的一組染色體疾病，占所有新生兒先天性異常的1%-2%，通常給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。增強(qiáng)的NIPT方法(NIPT-Plus)對(duì)染色體微缺失/微重復(fù)，例如DiGeorge綜合征，(22q11.22微復(fù)制，每3000-6000個(gè)新生兒會(huì)出現(xiàn)一個(gè)此染色體異常新生兒)，鑲嵌性和不平衡易位等染色體異常則能夠進(jìn)行檢測(cè)[18]。據(jù)研究，NIPT-Plus顯示出適用于檢測(cè)復(fù)發(fā)性MMS甚至潛在的全基因組MMS的一級(jí)篩選方法的標(biāo)志。NIPT-Plus在檢測(cè)具有臨床意義的微缺失和微重復(fù)方面表現(xiàn)出很高的靈敏度和特異性，而在檢測(cè)常見的非整倍體方面也保持了很高的靈敏度和特異性[2]。在過去的幾年中，也曾有多次報(bào)道提示，通過NIPT發(fā)現(xiàn)了先前隱匿的母體惡性腫瘤(淋巴瘤，白血病，卵巢，結(jié)直腸，肛門，和神經(jīng)內(nèi)分泌癌和平滑肌肉瘤)。[19,20]無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)于母體疾病早期診斷和治療是否會(huì)導(dǎo)致更好的生存率也需要更進(jìn)一步的數(shù)據(jù)收集及研究。

5 總結(jié)

盡管NIPT已被臨床醫(yī)生和患者廣泛接受，以檢測(cè)常見的胎兒三體性和性染色體異常，但仍存在關(guān)于檢測(cè)罕見染色體疾病綜合征的附加臨床價(jià)值的爭(zhēng)論。2016年，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)院更新了共識(shí)性指南，并建議無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查[21]。在我國(guó)，越來越多的圍產(chǎn)期醫(yī)生也傾向于優(yōu)先推薦使用NIPT進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)[22]。所有打算評(píng)估具有染色體異常胎兒可能性的孕婦都可以選擇產(chǎn)前檢查，而篩查階段為陽(yáng)性或有其他危險(xiǎn)因素的婦女則需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷：例如孕產(chǎn)婦高齡(35歲及以上)，遺傳病的家族病史或超聲檢查異常。在我國(guó)，通常建議35歲以上的孕婦直接接受侵入性產(chǎn)前診斷。但是，越來越多的專家認(rèn)為，將年齡作為選擇產(chǎn)前診斷的唯一指標(biāo)是不合適的。鑒于NIPT在產(chǎn)前檢查中的地位，因此應(yīng)實(shí)施周到的指導(dǎo)方針，同時(shí)還要對(duì)從業(yè)人員和患者進(jìn)行更好的教育。如果沒有指南，NIPT可能會(huì)導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)氐尼t(yī)療實(shí)踐，損害患者的知情和自由選擇權(quán)。關(guān)于當(dāng)前的NIPT指南，ACMG提倡將其用于常見的非整倍性染色體異常，且NIPT陽(yáng)性結(jié)果也需要結(jié)合侵入性產(chǎn)前診斷[21]。NIPT-Plus在檢測(cè)三體異常，SCA和與DiGeorge綜合征相關(guān)的最常見的22q11.2微缺失方面表現(xiàn)出高性能，據(jù)此，對(duì)于染色體微缺失比染色體非整倍性更為頻繁的年輕女性，可以常規(guī)進(jìn)行NIPT-Plus篩查。使用NIPT進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)正變得越來越普遍，而NIPT-Plus還將提供檢測(cè)染色體疾病綜合征的少見及罕見異常的可能性，這些染色體疾病綜合征在胎兒超聲檢查上沒有可見的異常，包括與智力障礙，發(fā)育遲緩，自閉癥以及大多數(shù)SCA相關(guān)的綜合征。因此，如果持續(xù)使用NIPT-Plus對(duì)所有孕婦進(jìn)行一線篩查，則可能對(duì)降低患有這些綜合征的新生兒的發(fā)病率及產(chǎn)生的重大影響。最后，臨床醫(yī)生應(yīng)熟悉所用測(cè)試的性能，并了解諸如產(chǎn)婦年齡和BMI之類的產(chǎn)婦狀況的影響，來綜合決定適宜的產(chǎn)前檢測(cè)方式。