堯可 蔡靖儀 趙蕾 吳亞菲 趙志河 申道南

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都610041

牙齦卟啉單胞菌作為導(dǎo)致慢性牙周炎的主要病原菌，與心血管疾病、糖尿病、阿爾茲海默癥等全身系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)[1]。面對(duì)宿主及口腔內(nèi)如pH、溫度、滲透壓、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗生素等復(fù)雜的生存環(huán)境，牙齦卟啉單胞菌需要靈敏地感知其變化并快速作出調(diào)整才能得以生存，并發(fā)揮毒力作用。這種適應(yīng)能力一定程度上依靠細(xì)菌的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal transduction system，TCS）[2]。TCS使細(xì)菌能夠感知、響應(yīng)和適應(yīng)各種環(huán)境變化。TCS 可調(diào)節(jié)細(xì)菌入侵、生物膜形成、趨化作用、脂多糖合成和抗生素耐受等多種與細(xì)菌致病性相關(guān)的基因的表達(dá)[3-6]。此外，TCS 亦可調(diào)節(jié)細(xì)菌自身生長(zhǎng)、分裂、代謝等多方面活動(dòng)[7]。

近年來(lái)，有關(guān)牙齦卟啉單胞菌TCS 的研究逐漸被報(bào)道，本文擬對(duì)當(dāng)前關(guān)于牙齦卟啉單胞菌的TCS的研究進(jìn)行綜述[8-10]。

1 TCS及其在牙齦卟啉單胞菌中的概況

TCS 廣泛存在于多種生物體內(nèi)，但在革蘭陰性菌中最為常見(jiàn)。一種細(xì)菌可擁有多種不同類型的TCS，其結(jié)構(gòu)不盡相同，隨感受的刺激信號(hào)和作用的目標(biāo)基因不同而有所變化。不同細(xì)菌內(nèi)TCS 的數(shù)目也有所不同，其數(shù)值與基因組的大小和所處生態(tài)位的多樣性有關(guān)[11-12]。

結(jié)構(gòu)上，典型的TCS 通常包括一個(gè)組氨酸激酶（histidine kinase，HK）和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（response regulator protein，RR）。HK 通常是含有組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，主要由胞外感應(yīng)器、跨膜區(qū)、胞內(nèi)連接區(qū)、激酶結(jié)構(gòu)域和ATP 結(jié)合區(qū)組成。其中，激酶結(jié)構(gòu)域即二聚和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶（dimerization and histidine phosphotransfer，DHp） 結(jié) 構(gòu) 域[13]。DHp結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)保守組氨酸殘基，可接受和傳遞磷酸基團(tuán)[14]。RR 則含有一個(gè)接受結(jié)構(gòu)域和一個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，接受結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)保守的天冬氨酸殘基，可接受來(lái)自HK的磷酸基團(tuán)。亦有約50%的RR 僅有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)發(fā)揮接受磷酸基團(tuán)和調(diào)節(jié)下游分子的作用[15]。

除了上述典型HK 外，還有一種含有一個(gè)起磷酸轉(zhuǎn)移作用的接收結(jié)構(gòu)域的混合型HK[14]。部分混合型HK 還含有一個(gè)組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。另外，部分RR 亦含有HK 結(jié)構(gòu)域，稱之為混合型RR[16-17]。通常，編碼感應(yīng)蛋白HK 的基因和編碼其同源RR 以及其它輔助成分的基因同屬一個(gè)操縱子。但是仍有部分HK 或RR 編碼基因單獨(dú)存在，缺少其相對(duì)應(yīng)的RR 或者HK 編碼基因。這類單獨(dú)存在的HK或者RR被稱為“孤兒”組件[16]。

功能上，細(xì)菌HK 通過(guò)其位于胞外的N 端感應(yīng)結(jié)構(gòu)域在檢測(cè)到細(xì)胞外環(huán)境的特定變化后，其ATP 結(jié)構(gòu)域結(jié)合ATP，并將其磷酸基團(tuán)傳遞至DHp 結(jié)構(gòu)域中保守的組氨酸殘基實(shí)現(xiàn)自身磷酸化反應(yīng)。然后，同源RR 催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至RR 的接收結(jié)構(gòu)域上的天冬氨酸殘基。這通常會(huì)觸發(fā)構(gòu)象變化激活RR 的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而激活（或抑制）靶基因的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)[14]。另外，部分RR 亦可直接結(jié)合RNA 或者蛋白質(zhì)，甚至通過(guò)自身的酶活性發(fā)揮作用[7]。激活的RR 則可通過(guò)HK 的磷酸酶活性、自身去磷酸化作用或者磷酸酶輔助的去磷酸化作用回到基態(tài)水平[7]。反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的總體磷酸化水平最終控制其活性。

在齦下菌斑內(nèi)，牙齦卟啉單胞菌不僅需要面對(duì)復(fù)雜多變的環(huán)境，還要應(yīng)對(duì)包括宿主的免疫防御體系，以及生物膜中其他微生物產(chǎn)生的代謝物等的挑戰(zhàn)。依此推定牙齦卟啉單胞菌的各個(gè)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在其生存和發(fā)揮毒力中的具有重要調(diào)控作用。目前研究已知，牙齦卟啉單胞菌的ATCC33277 菌株含有5 對(duì)完整的TCS 和2 種“孤兒”成分，W83 菌株則含有4 對(duì)完整TCS 和4 種“孤兒”成分[8-10]。相對(duì)于其他革蘭陰性細(xì)菌，牙齦卟啉單胞菌的TCS 數(shù)量相對(duì)較少，一方面，這可能與其專性厭氧的嚴(yán)苛生存條件有關(guān)，有相對(duì)局限的特定定植部位；另一方面也可能與細(xì)菌進(jìn)化相關(guān)，預(yù)示著其不同雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相互之間以及與其他系統(tǒng)之間可能存在著復(fù)雜的交互調(diào)控作用，牙齦卟啉單胞菌通過(guò)組成簡(jiǎn)單但高效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)特定的挑戰(zhàn)。接下來(lái)，筆者將對(duì)目前研究較多的牙齦卟啉單胞菌TCS，即FimS/FimR、HaeS/HaeR、PorX/PorY、GppX、RprY系統(tǒng)的組成和功能進(jìn)行闡述。

2 FimS/FimR

FimS/FimR TCS 在ATCC33277 和W83 菌 株 中分別 由PGN_0904/PGN_0903 和PG1432/PG1431 編碼。作為牙齦卟啉單胞菌中研究最為深入的TCS，其組氨酸激酶FimS 和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白FimR 最早由Hayashi 等[18]在轉(zhuǎn)位子誘導(dǎo)的菌毛缺陷變異株中發(fā)現(xiàn)。FimS和FimR的基因位于不同的操縱子，預(yù)示著他們可能與其他HK或RR存在著交叉調(diào)控作用，以增加其對(duì)復(fù)雜的環(huán)境變化的適應(yīng)性。Lo 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制基因fimS 的表達(dá)導(dǎo)致牙齦卟啉單胞菌的10%的基因表達(dá)變化。而相比之下，Nishikawa 等[20]發(fā)現(xiàn)fimR 基因缺陷菌株僅影響7 種基因的表達(dá)。這表明FimS 和FimR 之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而與其他系統(tǒng)或分子存在著復(fù)雜的交互作用。

Nishikawa 等[21]通過(guò)比較ATCC33277 菌株以及天然的菌毛缺陷株W83 發(fā)現(xiàn)，天然菌毛缺陷株W83 中的FimS 缺乏激酶結(jié)構(gòu)域，因而不能結(jié)合ATP 發(fā)揮磷酸化作用。所以該菌株內(nèi)雖然有fimA基因，但卻沒(méi)有fimA 轉(zhuǎn)錄物或FimA 蛋白。在ATCC33277 菌株中，F(xiàn)imS/FimR TCS 可影響牙齦卟啉單胞菌菌毛和生物膜的形成[19-22]。牙齦卟啉單胞菌表面主要有2 種不同的菌毛[23-24]。長(zhǎng)菌毛由fimA 基因編碼的蛋白亞基FimA 組成，短菌毛由一大小為67 kg·mol-1蛋白Mfa1構(gòu)成。2種菌毛均為細(xì)菌生物膜形成所必須，且都與致病性密切相關(guān)[25]。一方面，F(xiàn)imS/FimR TCS 與FimA 的功能密切相關(guān)，fimS/fimR 基因表達(dá)缺陷將導(dǎo)致fim 基因簇和FimA 等蛋白表達(dá)量顯著下降[18,21]。而通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)向fimR 基因缺陷變異株中引入fimR 基因，則可恢復(fù)FimR 和FimA 蛋白和細(xì)菌表面菌毛的表達(dá)[26]。

Nishikawa 等[20]進(jìn)一步探究了其作用的分子機(jī)制后發(fā)現(xiàn)，活化的FimR 并不是直接結(jié)合到fimA基因的啟動(dòng)子，而是通過(guò)結(jié)合至fim 基因簇中第一個(gè)基因fimX 的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)揮作用，fimX 才是FimR 蛋白的目標(biāo)基因，其產(chǎn)物還可反過(guò)來(lái)進(jìn)一步調(diào)節(jié)包括fimA 在內(nèi)的fim 基因簇的基因表達(dá)。另一方面，Wu 等[22]的研究顯示：mfa1 基因表達(dá)也與FimS/FimR TCS 的調(diào)節(jié)相關(guān)，但與長(zhǎng)菌毛的調(diào)控不同的是，F(xiàn)imR 直接與mfa1基因的啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮作用。

3 HaeS/HaeR

HaeS/HaeR由PGN_0752/PGN0753（ATCC33277菌株）或PG0719/PG0720（W83 菌株）編碼。ATCC33277菌株的PGN_0752基因存在天然的缺失突變，相應(yīng)的HK 和RR 的表達(dá)均顯著降低，導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。

Mattos-Graner等[27]通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀芯片技術(shù)初步確定HaeS/HaeR 編碼的TCS 參與牙齦卟啉單胞菌鐵/血紅素獲得相關(guān)基因的調(diào)控。含鐵血紅素是牙齦卟啉單胞菌生存的必需營(yíng)養(yǎng)素之一，Scott等[28]檢測(cè)到HaeR 可結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)菌與獲取含鐵血紅素、轉(zhuǎn)運(yùn)離子等生物過(guò)程相關(guān)的基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HaeR 的生物學(xué)功能受含鐵血紅素濃度和目標(biāo)基因的影響，可在不同條件下促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的表達(dá)。

當(dāng)含鐵血紅素濃度升高時(shí)，HaeR與PGN_0704（ihtA）、PGN_0687（htrA）和PGN_0556（hmuS）三者上游非編碼區(qū)域結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮正向調(diào)控作用，而對(duì)TonB 依賴的受體、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和RgpA、Kpg 的表達(dá)發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用[28]。由此可知，當(dāng)含鐵血紅素濃度較低時(shí)，HaeS 的胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域與血紅素親和力增強(qiáng)，促進(jìn)與細(xì)菌獲取血紅素相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生成，而當(dāng)含鐵血紅素充足時(shí)，兩者親和力降低，以控制HaeR活性。

4 PorX/PorY

PorX/PorY的HK是PorY（ATCC33277：PGN_2001，W83：PG0052），而RR是PorX（ATCC33277：PGN_1019，W83：PG0928）。PorX/PorY TCS可通過(guò)影響Ⅸ型分泌系統(tǒng)（type Ⅸsecretion system，T9SS）的功能調(diào)節(jié)牙齦素等物質(zhì)的分泌。T9SS 是存在于纖維桿菌-綠菌-擬桿菌超門細(xì)菌中的一種革蘭陰性菌蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)的跨細(xì)胞外膜分泌過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[29]。T9SS 被證明可促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌中的牙齦素和肽酰基精氨酸脫亞胺酶（peptidylarginine deiminase，PAD）的釋放[30-31]。在牙齦卟啉單胞菌ATCC33277 菌株中，通過(guò)蛋白組學(xué)研究等方法，研究者共鑒定出包括porX和porY在內(nèi)的11種參與牙齦素和PAD胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的por基因[31-34]。其中，PorX和PorY組成的雙組分系統(tǒng)可調(diào)節(jié)其他por 基因的表達(dá)。Sato等[31]通過(guò)基因芯片分析表明，相比于野生型菌株，porX 和porY 基因變異株細(xì)菌中20 種基因表達(dá)量下降了超過(guò)40%，其中包括與牙齦素分泌相關(guān)的porT、porK、porL、porM、porN、porP 和sov 等T9SS 相關(guān)基因。Kadowaki等[35]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在Mn2+存在條件下，PorY 將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至PorX，活化的PorX 與胞質(zhì)外功能sigma 因子SigP 直接作用，而后SigP 與編碼T9SS 系統(tǒng)組分的基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)T9SS 組分基因表達(dá)過(guò)程。另外，Vincent等[36]運(yùn)用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)，PorX 并未與T9SS基因啟動(dòng)子結(jié)合直接調(diào)節(jié)T9SS基因表達(dá)，而是與T9SS跨膜復(fù)合體組分之一的PorL蛋白的胞質(zhì)內(nèi)的疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因而PorX對(duì)T9SS中分子的調(diào)控作用有可能是間接調(diào)控。

5 GppX

牙齦卟啉單胞菌中存在一種混合型TCS，其組胺酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域共同存在于由961個(gè)氨基酸組成的GppX蛋白質(zhì)（PGN_1768或PG1797）中。據(jù)推測(cè)，GppX 蛋白含有一個(gè)嵌入胞膜的N 端感應(yīng)激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋模體的C 端反應(yīng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[37]。Hasegawa 等[37]最早發(fā)現(xiàn)，GppX 與牙齦卟啉單胞菌牙齦素的成熟和定位以及色素生成有關(guān)，gppX 基因變異株的rgpA、rgpB 和kgp 基因表達(dá)雖然在轉(zhuǎn)錄水平上與野生型菌株相當(dāng)，但牙齦素的活性卻相對(duì)較低，并且多位于培養(yǎng)基上清液中而非胞內(nèi)，另外突變株的細(xì)菌菌落也缺乏特征性的色素沉著。James 等[38]發(fā)現(xiàn)，GppX 還可通過(guò)調(diào)節(jié)luxS 基因表達(dá)來(lái)影響牙齦卟啉單胞菌對(duì)氯化血紅素和礦物離子的攝取以及Kpg 的表達(dá)，在gppX 變異株中，luxS 基因的表達(dá)量是野生型菌株的2 倍以上，TonB 連接的血紅素結(jié)合蛋白Tlr和HmuR的基因表達(dá)則分別上調(diào)3倍和下降5倍左右。通過(guò)對(duì)luxS 變異株RNA 進(jìn)行測(cè)序，Hirano等[39]證實(shí)了luxS 對(duì)包括hmuR 在內(nèi)的57 種基因的調(diào)控作用。然后，Hirano等[40]再次通過(guò)RNA 測(cè)序的方法，發(fā)現(xiàn)gppX 變異株共有53 種基因上調(diào)，37種基因下調(diào)；研究人員進(jìn)一步研究了GppX對(duì)基因PGN_0151 的作用發(fā)現(xiàn)，GppX 可直接結(jié)合到與PGN_0151 共同轉(zhuǎn)錄的基因PGN_0152 的啟動(dòng)子上促進(jìn)二者轉(zhuǎn)錄，且GppX-PGN_0151 調(diào)節(jié)子和細(xì)菌的生物膜形成密切相關(guān)，與野生型細(xì)菌相比，gppX 和PGN_0151 變異株形成生物膜的能力均明顯下降。

6 RprY

在脆弱擬桿菌和其他擬桿菌門菌如中間普雷沃菌和福賽斯坦納菌中，rprY 和其同源HK 基因rprX 相鄰。但與其他細(xì)菌中不同的是，牙齦卟啉單胞菌中的RprY 是一種“孤兒”RR，缺乏一般TCS 中的同源HK，由PGN_1186（ATCC 33277）或者PG1089（W83）基因編碼。最近Li 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌為彌補(bǔ)RprX 的缺失，通過(guò)乙?；饔脕?lái)調(diào)節(jié)RprY的活性，而乙酰化的RprY結(jié)合目標(biāo)DNA的能力也因此發(fā)生變化。

Duran-Pinedo等[42]通過(guò)比較rprY 變異株和野生型牙齦卟啉單胞菌的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，RprY 主要參與細(xì)菌兩方面活動(dòng)的調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)運(yùn)功能和氧化應(yīng)激；Na+轉(zhuǎn)運(yùn)還原型輔酶Ⅰ-泛醌氧化還原酶（nicotinamide adenine dinucleotide:ubiquinone oxidoreductase，NQR）基因表達(dá)在野生型菌株中是變異株的4倍，而外排泵和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過(guò)氧化物歧化酶等基因在變異株中則被激活。進(jìn)一步Krishnan等[43]研究發(fā)現(xiàn)，rprY 變異株在Na+缺乏的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到限制，同時(shí)Na+缺乏的環(huán)境可引起牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生較強(qiáng)的氧化應(yīng)激，而RprY 作為一種抑制分子，可通過(guò)與過(guò)氧化氫酶或熱休克蛋白等分子伴侶的基因，如groES、clpB、dnaK等直接結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)；該實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，RprY 亦可結(jié)合至自身基因，發(fā)揮自我調(diào)節(jié)作用。關(guān)于RprY 的其他研究[44]顯示，RprY 還可與編碼NQR 操縱子內(nèi)第一個(gè)基因nqrA 的啟動(dòng)子結(jié)合，參與牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)能過(guò)程。并且Lewis等[45]發(fā)現(xiàn)，在亞硝酸鹽刺激下，牙齦卟啉單胞菌的rprY基因表達(dá)也存在上調(diào)，提示RprY 可能參與了牙齦卟啉單胞菌的更多生命活動(dòng)。

7 其他

ATCC33277 菌株中還有2 個(gè)完整的TCS 系統(tǒng)PGN_0012/0013和PGN_0774/0775，目前鮮有研究對(duì)其進(jìn)行報(bào)道，研究者[46]通過(guò)轉(zhuǎn)座子高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PGN_0012 的突變體在小鼠腹腔膿腫模型中表現(xiàn)出極低的適應(yīng)性。對(duì)2個(gè)系統(tǒng)的功能基團(tuán)進(jìn)行搜索后發(fā)現(xiàn)，2 組TCS 都屬于NtrC 家族，該家族在其他革蘭陰性菌中被報(bào)告與Ⅲ型分泌系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的調(diào)節(jié)相關(guān)[47]。目前關(guān)于該TCS 的研究尚處于早期階段，關(guān)于其調(diào)控作用仍需更多的研究來(lái)拓展。

8 問(wèn)題和展望

牙齦卟啉單胞菌在牙周炎和相關(guān)全身系統(tǒng)性疾病中的作用已得到公認(rèn)，雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在牙齦卟啉單胞菌的自身調(diào)控和致病性中扮演著極為重要的角色。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于牙齦卟啉單胞菌的TCS 的研究報(bào)道相對(duì)有限，導(dǎo)致學(xué)界對(duì)牙齦卟啉單胞菌的TCS 的結(jié)構(gòu)、功能和機(jī)制認(rèn)識(shí)尚有不足。本綜述可為牙齦卟啉單胞菌的相關(guān)研究提供更多思路，也能對(duì)臨床預(yù)防和治療工作有所啟發(fā)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。