王亞飛，宋凌燕，馮都都，馬良，王晉霞，陳莎麗，史盟浩，李豪哲，曹慧媛，匡雪莉，紀愛芳

(長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院檢驗科，山西 長治 046000)

0 引言

新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起的肺炎從2019年底開始廣泛傳播，并在全球蔓延，形勢十分嚴峻。COVID19已經(jīng)成為世界衛(wèi)生公共安全所要面對的問題。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，新型冠狀病毒肺炎確診病例的診斷標準為有流行病學史和臨床表現(xiàn)的疑似病例同時具備病原學或血清學證據(jù)之一者。常用的病原學證據(jù)即為實時熒光RT-PCR檢測2019-nCoV核酸陽性[1]。為確保本室新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果質(zhì)量的可靠，根據(jù)《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》(CNAS-CL02-A009)和《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》(CNAS-GL039)，對上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV核酸檢測試劑盒在Lepgen-96全自動醫(yī)用PCR儀上的性能驗證，內(nèi)容包括方法符合率、檢出限、精密度、交叉反應等[2-3]。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

健康體檢者咽拭子2019-nCoV核酸檢測陰性樣本。2019-nCoV RNA液體性能驗證參考品(廣州邦德盛公司)，濃度為2.0×106copies/mL和2.0×105copies/mL的2019-nCoV RNA假病毒核酸標準物質(zhì)編號分別為GBW(E) 091133和GBW(E) 091132。陰性對照及陽性對照為試劑盒配套。

1.2 試劑和儀器

核酸提取試劑和EX3600全自動核酸提取儀(上海之江生物科技股份有限公司)、新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑(上海伯杰醫(yī)療科技有限公司)、Lepgen-96全自動醫(yī)用PCR儀(山東鑫貝西科學儀器有限公司)。

1.3 方法

按核酸提取試劑盒說明書進行核酸提取，實時熒光RTPCR測定按核酸檢測試劑說明書操作，用ORF1ab基因和N基因作為檢測靶基因。擴增條件：50℃，15min；95℃，15min；94℃，15s，55℃，45s，40個循環(huán)。使用配套軟件(Real-Time PCR軟件v2.4)進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)擴增曲線，調(diào)整基線和熒光閾值，得到不同通道循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。陽性標準為FAM和VIC通道有明顯擴增曲線，且Ct≤40；陰性標準為FAM和VIC通道無擴增曲線或Ct值＞40，且Cy5通道有擴增曲線；如僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一條通道無擴增曲線，則結(jié)果需復檢，復檢結(jié)果一致可判為陽性，復檢均為陰性則判為陰性。

1.4 性能驗證方法

1.4.1 符合率

選用相同檢測方法的通過ISO15189認可和衛(wèi)生健康委員會組織的2019-nCoV核酸檢測室間質(zhì)評的實驗室作為參比實驗室。選取陰陽性樣本各6例，其中陰性樣本為健康體檢2019-nCoV核酸為陰性的樣本、陽性樣本3例使用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒SARS-CoV2企業(yè)參考品2(濃度為5×103copies/mL，貨號：ZC-HX-201CKP2)進行原倍、2倍、20倍稀釋，2例使用檢測試劑盒自帶陽性對照品(濃度為1×105copies/mL)進行原倍、100倍稀釋。1例使用廣州邦德盛生物科技有限公司生產(chǎn)的室內(nèi)質(zhì)控品S1(濃度為2.19×103批號為2020013)。按照患者樣本檢測程序與參比實驗室進行比對，以參比實驗室結(jié)果為準，計算本實驗室與參比實驗室的總符合率、陽性符合率和陰性符合率。

1.4.2 檢出限

根據(jù)試劑說明書聲明的檢出限為500copies/mL，使用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒SARSCoV2企業(yè)參考品2(濃度為5×103copies/mL，貨號：ZC-HX-201CKP2)進行10倍稀釋后重復測定5次，100%檢出靶核酸，則檢出限驗證合格。

1.4.3 交叉反應

本實驗使用的分析特異性參考品為廣州中山達安公司生產(chǎn)的標準物質(zhì)。取一定濃度與待測核酸可能存在交叉反應的病原體加入經(jīng)確認為陰性的樣本中，與常規(guī)標本一樣處理，至少重復檢測3次。判斷標準為結(jié)果應為陰性。

1.4.4 精密度

檢測濃度為5.0×103copies/mL和5.0×105copies/mL的參考品，同一份樣本重復測定10次，計算各靶基因Ct值的變異系數(shù)，評價批內(nèi)不精密度。每份樣本重復測定2次，連續(xù)測定5天，計算各靶基因Ct值的變異系數(shù)，評價批間不精密度。判斷標準為符合說明書聲明范圍批內(nèi)、批間CV均不大于5.0%則驗證合格。

2 結(jié)果

2.1 符合率

本試劑檢測結(jié)果與參比實驗室檢測結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)6例陽性標本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，6例陰性標本均沒有Ct值，總符合率、陽性符合率和陰性符合率均為100%，符合率驗證合格。

2.2 檢出限

在檢測下限驗證中，本試劑盒對濃度為5.0×102copies/mL的2019-nCoV RNA陽性樣本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，檢出率為100%。結(jié)果符合試劑說明書聲明標準，檢出限驗證合格。

2.3 交叉反應

交叉反應驗證中檢測含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、人巨細胞病毒、EB病毒、肺炎支原體、結(jié)核分枝桿菌樣本的2019-nCoV陰性樣本，重復3次的N基因及ORF1ab基因Ct值均＜40，結(jié)果均為2019-nCoV陰性。

2.4 精密度

重復性驗證中5.0×105copies/mL 濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分別為0.53%和0.48%；5.0×103copies/mL 濃度水平的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為0.75%和0.61%。批間不精密度驗證中5.0×105copies/mL 濃度的N基因和ORF1ab 基因的Ct值CV分別為1.98%和2.01%；5.0×103copies/mL濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV為1.41%和2.15%。CV符合試劑說明書要求標準(＜5%)，精密度驗證合格。

3 討論

熒光定量聚合酶鏈式反應在核酸檢測中具有很高的靈敏度和特異度、高通量等優(yōu)點作為新型冠狀病毒肺炎的確診方法[4]，在快速診斷、疫情防控中發(fā)揮了及其重要作用。隨著新冠肺炎防治的常態(tài)化，SARS-CoV-2核酸檢測也更加常規(guī)化。為確保本室新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果質(zhì)量的可靠，根據(jù)《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》(CNAS-CL02-A009)和《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》(CNAS-GL039)，核酸檢測試劑進入臨床使用前應進行性能驗證。

本研究所驗證的核酸檢測試劑以2019-nCoV的ORF1ab和N基因設計特異性引物和熒光探針通過熒光定量PCR儀進行擴增，實現(xiàn)對新冠病毒核酸的檢測。準確度是指測量結(jié)果與真實結(jié)果之間的接近程度或一致性。本研究對6份陽性質(zhì)控及6份陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果與真實值完全一致，說明檢驗結(jié)果準確可靠。精密度是在規(guī)定條件下，對同一被測對象多次重復測量所得結(jié)果的一致程度，通常以標準差或變異系數(shù)表示。本研究顯示批內(nèi)精密度高濃度標本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分別為0.53%和0.48%；低濃度標本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為0.75%和0.61%。批間精密度高濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為1.98%和2.01%；低濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV為1.41%和2.15%。批內(nèi)精密度變異系數(shù)均在1%以內(nèi)，批間精密度變異系數(shù)均在3%以內(nèi)，符合廠家批內(nèi)批間精密度小于5%的聲明，說明試劑性能穩(wěn)定，重復性好。檢出限是指試劑對待測樣本的檢測能力，即靈敏度。驗證試劑的靈敏度，即是對低濃度樣本(檢出限)的檢出率。本研究顯示樣本濃度在500copies/mL的時候在檢測結(jié)果均為陽性，滿足說明書的檢測限，說明該試劑具有足夠的檢測能力。最低檢出限是分子診斷產(chǎn)品的重要指標，設置較低容易造成假陽性，設置過高容易造成假陰性[5]。因此在弱陽性樣本的判斷上，不同核酸檢測試劑盒產(chǎn)品可能會得出不同結(jié)論。對于此也有研究表明不同試劑對弱陽性樣本檢出能力是有很大差異[6,7]。因此有研究建議對于沒有灰區(qū)設置的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒，當檢出的Ct值與判斷陽性閾值的Ct值的差小于3時，建議進行重復實驗，以排除假陽性或假陰性的可能[8]。交叉反應主要是驗證與檢測對象可能存在交叉反應的核酸物質(zhì)對檢測的影響，對于冠狀病毒核酸檢測來說，主要與檢測對象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，由于本室資源有限僅驗證了甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、EB 病毒、人巨細胞病毒和結(jié)核分枝桿菌無交叉反應。

雖然試劑盒上市前經(jīng)過了嚴格的臨床試驗，但是進入新實驗室臨床檢驗前還需進行性能評價，以驗證其產(chǎn)品符合其聲明的范圍，保證檢驗質(zhì)量的可靠性。本研究結(jié)果表明上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒在Lepgen-96全自動醫(yī)用PCR儀上兩個濃度的參考品兩個靶基因的批內(nèi)批間精密度均小于5%，陰陽性符合率達100%，驗證了其聲明的最低檢出限為500copies/mL，交叉反應等參數(shù)進行基本符合臨床應用要求。