羅伏兵， 徐發(fā)榮， 王慧強(qiáng)， 馬志軍， 湯新明， 劉賢勇， 索 勛， 劉曉冬

(1．北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 北京大興102629 ； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京海淀100193)

艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria)基因組約60 Mbp，可編碼8 000～9 000個(gè)蛋白，組分復(fù)雜[1]。分析異源抗原在基因重組球蟲(chóng)混合組分中所占比重是優(yōu)化抗原表達(dá)水平的基礎(chǔ)。常規(guī)蛋白定量方法主要是基于蛋白分子間化學(xué)鍵或氨基酸特性等建立的檢測(cè)蛋白總量的方法，而無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)混合蛋白組分中某一特定/單一蛋白的含量。免疫學(xué)檢測(cè)方法利用抗原抗體特異性的結(jié)合反應(yīng)能夠準(zhǔn)確檢出復(fù)雜組分中特定蛋白抗原或抗體，并能實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測(cè)的目的。ELISA是最常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法之一，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)以表達(dá)熒光蛋白的基因重組球蟲(chóng)為模型，利用熒光蛋白特異性的抗體，建立檢測(cè)基因重組球蟲(chóng)可溶性蛋白中熒光蛋白含量的夾心ELISA方法，為評(píng)估基因重組球蟲(chóng)表達(dá)異源抗原的含量和優(yōu)化其作為疫苗載體的研究提供了科學(xué)依據(jù)； 同時(shí)也為其他類(lèi)型疫苗載體或相關(guān)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株與試劑 本文所用野生球蟲(chóng)株、基因重組球蟲(chóng)株EtM2e[2]和EtER[3]，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國(guó)家動(dòng)物原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存與擴(kuò)繁。兔源黃色熒光蛋白多克隆抗體(Rabbit polyclonal to GFP,Proteintech)、鼠源黃色熒光蛋白單克隆抗體(Mouse monoclonal to GFP,Beyotime)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(Proteintech)及BCA蛋白定量試劑盒均為商品化試劑。黃色熒光蛋白對(duì)照品系經(jīng)原核表達(dá)、純化產(chǎn)物，并測(cè)定濃度。

1.2 基因重組球蟲(chóng)蛋白提取 球蟲(chóng)可溶性蛋白的提取方法依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，取新鮮收取并純化后的EtM2e和EtER球蟲(chóng)株5.0×107個(gè)孢子化卵囊，經(jīng)液氮研磨后，加入適量蛋白裂解液，離心取上清即得球蟲(chóng)可溶性蛋白，BCA法(按照說(shuō)明書(shū)操作)測(cè)定球蟲(chóng)蛋白濃度后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 包被抗體濃度優(yōu)化 ELISA方法及所用試劑配制等依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]。簡(jiǎn)言之，以兔源黃色熒光蛋白多克隆抗體為包被抗體，分別經(jīng)1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280稀釋后，每孔100 μL加入ELISA板中，4 ℃過(guò)夜包被。以5%脫脂乳、37 ℃封閉2 h。每孔加入100 μL原核表達(dá)的黃色熒光蛋白(2 μg/mL)，37 ℃反應(yīng)1 h；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。每孔加入100 μl鼠源黃色熒光蛋白單克隆抗體100 μL(1∶1 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h。每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗100 μL(1∶5 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h后加入TMB顯色5 min。終止反應(yīng)后測(cè)定OD450和OD630的吸光度值。以達(dá)到最大吸光度值的最大抗體稀釋倍數(shù)確定包被濃度。

1.4 檢測(cè)抗體濃度優(yōu)化 以1.3確定的抗體包被濃度進(jìn)行包被，封閉后每孔加入100 μL原核表達(dá)的黃色熒光蛋白(2 μg/mL)，37 ℃反應(yīng)1 h；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。每孔加入100 μL鼠源黃色熒光蛋白單克隆抗體100 μL(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、 1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h。其他操作同1.3，確定檢測(cè)抗體濃度。

1.5 檢測(cè)基因重組黃色熒光蛋白體系的建立與優(yōu)化 以1.3確定的抗體包被濃度進(jìn)行包被，封閉后每孔加入100 μL原核表達(dá)的黃色熒光蛋白(0、0.001 9、0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL)，37 ℃反應(yīng)1 h；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。每孔加入100 μL鼠源黃色熒光蛋白單克隆抗體100 μL(1.4確定的檢測(cè)抗體濃度)，37 ℃反應(yīng)1 h。其他操作同1.3，檢測(cè)不同濃度的重組黃色熒光蛋白與吸光度值之間的線(xiàn)性關(guān)系。

1.6 球蟲(chóng)可溶性蛋白中黃色熒光蛋白含量測(cè)定 以1.3和1.4確定的包被抗體與檢測(cè)抗體濃度，加入已知總濃度的基因重組球蟲(chóng)可溶性蛋白，同時(shí)設(shè)置不同濃度原核表達(dá)的黃色熒光蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以野生型球蟲(chóng)可溶性蛋白作為對(duì)照，按照1.3反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。以不同濃度原核表達(dá)的黃色熒光蛋白及其對(duì)應(yīng)的OD450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得到吸光度值與蛋白濃度的線(xiàn)性方程。根據(jù)基因重組球蟲(chóng)蛋白孔的吸光度值和線(xiàn)性方程推算球蟲(chóng)可溶性蛋白中黃色熒光蛋白的濃度，進(jìn)而確定其表達(dá)水平。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析 所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel(2016)軟件進(jìn)行處理與分析，部分圖片采用GraphPad Prism 7.0軟件生成。

2 結(jié)果

2.1 夾心ELISA方法的建立 為了建立有效的檢測(cè)混合組分中特定/單一蛋白含量的夾心ELISA方法，本文以黃色熒光蛋白為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)包被抗體的濃度、檢測(cè)抗體的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，以2 μg/mL原核表達(dá)的黃色熒光蛋白為檢測(cè)對(duì)象，商品化的兔源黃色熒光蛋白多克隆抗體作為包被抗體，吸光度值隨著其稀釋倍數(shù)的降低而升高，在1∶20 時(shí)達(dá)到飽和(圖1)。同樣，商品化的鼠源黃色熒光蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，吸光度值隨著其稀釋倍數(shù)的降低而升高，在1∶4 000時(shí)達(dá)到飽和(圖2)。在此條件下(包被抗體1∶20稀釋?zhuān)瑱z測(cè)抗體1∶4 000稀釋)，不同濃度的黃色熒光蛋白與吸光度值之間呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系。因此，本文將包被抗體的濃度確定為1∶20稀釋?zhuān)瑢z測(cè)抗體的濃度確定為1∶4 000稀釋。

2.2 基因重組球蟲(chóng)可溶性蛋白中黃色熒光蛋白含量的測(cè)定 基因重組球蟲(chóng)表達(dá)異源蛋白的水平受啟動(dòng)子的調(diào)控。對(duì)比組蛋白4(His4)和膜抗原13(SAG13)啟動(dòng)子調(diào)控黃色熒光蛋白表達(dá)的基因重組球蟲(chóng)EtM2e和EtER，前者的熒光蛋白強(qiáng)度弱于后者(見(jiàn)中插彩版圖3)。利用建立的夾心ELISA方法對(duì)2株基因重組球蟲(chóng)熒光蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。首先建立黃色熒光蛋白濃度和吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，呈正相關(guān)線(xiàn)性關(guān)系(y=0.920 7x+0.096 3，R2=0.991 2)。以100.0 μg/mL的EtM2e和EtER可溶性抗原加入檢測(cè)體系，吸光值分別為0.382和0.865，即黃色熒光蛋白的濃度分別為0.31 μg/mL和0.94 μg/mL。而加入野生型球蟲(chóng)可溶性蛋白的吸光度值為0.01，說(shuō)明球蟲(chóng)組分與包被抗體和檢測(cè)抗體無(wú)交叉反應(yīng)。因此，黃色熒光蛋白在EtM2e和EtER可溶性蛋白的占比分別為3.1‰和9.4‰，證實(shí)SAG13啟動(dòng)子調(diào)控異源蛋白表達(dá)的水平優(yōu)于His4啟動(dòng)子，與熒光顯微鏡觀(guān)察一致。

圖1 包被抗體最佳包被濃度的確定Fig.1 Determination of the optimal coating concentration of coated antibodies

圖2 檢測(cè)抗體最佳稀釋濃度的確定Fig.2 Determination of the optimal dilution concentration of the detection antibody

3 討論

本試驗(yàn)建立了測(cè)定球蟲(chóng)混合可溶性組分中黃色熒光蛋白含量的夾心ELISA方法，具有較高的靈敏性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒獾鞍妆磉_(dá)水平的定量比較，為后續(xù)基因重組球蟲(chóng)作為疫苗載體啟動(dòng)子的選擇等提供參考。

與常規(guī)蛋白定量方法，如雙縮脲法、Lowry法、紫外分光光度法、考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法和BCA法等相比，本試驗(yàn)建立的夾心ELISA方法優(yōu)勢(shì)在于能夠檢測(cè)混合蛋白組分中特定/單一蛋白的含量或濃度[4]。影響夾心ELISA方法檢測(cè)效果的因素很多，包括包被液、封閉液的選擇，包被和抗原抗體反應(yīng)時(shí)間等[5]，本試驗(yàn)僅對(duì)包被抗體和檢測(cè)抗體的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，其他反應(yīng)條件則采取實(shí)驗(yàn)室前期建立的ELISA檢測(cè)體系，檢測(cè)靈敏度可達(dá)3.0 ng。在后續(xù)研究中，可對(duì)其他條件進(jìn)行優(yōu)化來(lái)提升檢測(cè)的靈敏度。對(duì)本試驗(yàn)而言，影響檢測(cè)效果的因素還包括包被抗體和檢測(cè)抗體的特異性與反應(yīng)性：(1) 球蟲(chóng)可溶性組分復(fù)雜，包含數(shù)千種蛋白，除與特定蛋白黃色熒光蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)外，與其他組分應(yīng)無(wú)交叉反應(yīng)(2.2結(jié)果已證實(shí))；(2) 包被抗體、檢測(cè)抗體與酶標(biāo)二抗之間應(yīng)無(wú)交叉免疫反應(yīng)(2.1結(jié)果已證實(shí))。

艾美耳球蟲(chóng)生活史復(fù)雜，宿主體內(nèi)的裂殖生殖階段異源抗原隨著蟲(chóng)體的大量擴(kuò)增而擴(kuò)增，被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，激發(fā)免疫應(yīng)答，這也是球蟲(chóng)作為疫苗載體的優(yōu)勢(shì)之一[6-7]?；蛑亟M球蟲(chóng)表達(dá)異源蛋白的水平在內(nèi)生性發(fā)育的不同階段表達(dá)水平可能存在差異，本試驗(yàn)基于孢子化卵囊階段的基因重組球蟲(chóng)表達(dá)異源蛋白的水平，為分析內(nèi)生性發(fā)育各階段異源抗原的表達(dá)水平提供了科學(xué)依據(jù)。挖掘高效的持家基因啟動(dòng)子是提升基因重組球蟲(chóng)表達(dá)異源蛋白水平的有效策略，也是優(yōu)化其作為疫苗載體的突破口之一。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種測(cè)定混合組分中特定/單一蛋白含量的夾心ELISA方法，具有較高的靈敏性。