劉忠卓， 單曉楓， 靳勝男， 田佳鑫， 張 偉， 康元環(huán)， 錢愛東

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 2. 吉林省圖們市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心， 吉林圖們133100)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬氣單胞菌科，氣單胞菌屬，是一種重要的人-獸-水生動(dòng)物共患病原菌。該菌廣泛存在于自然界水域及土壤當(dāng)中，其中部分菌株致病能力較強(qiáng)，可引起魚類等水生動(dòng)物皮膚潰爛、臟器出血及腹腔積液等，嚴(yán)重時(shí)可造成大量死亡 ； 同時(shí)該菌還可感染人類，導(dǎo)致人類胃腸炎和菌血癥等疾病[1]。近年來，有關(guān)維氏氣單胞菌感染所引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病頻繁暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了經(jīng)濟(jì)損失，但因養(yǎng)殖業(yè)者對(duì)抗生素藥物的不合理應(yīng)用，促使該致病菌產(chǎn)生了多重耐藥性[2]； 此外，由于抗生素在養(yǎng)殖環(huán)境中不易消除，其不僅給水產(chǎn)品的質(zhì)量安全帶來隱患，而且還嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境。因此，尋求一種能替代抗生素且有效、安全的漁用藥物對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)至關(guān)重要。在替代抗生素的備選漁藥中，中草藥及其提取物顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其具有抗病菌、抗病毒及改善水產(chǎn)品質(zhì)量等作用，并具不易產(chǎn)生耐藥性、環(huán)保及能提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力等優(yōu)點(diǎn)[3]，越來越受到人們的關(guān)注，而從中草藥中研制與開發(fā)新型的漁用藥物也成為了水產(chǎn)防治疾病的一個(gè)新方向。

丁香酚(Eugenol)是丁香、月桂、樟腦等許多藥用植物揮發(fā)油的主要成分，其是一種有機(jī)酚，常溫下為微黃色的油狀液體，在空氣中易揮發(fā)且伴有強(qiáng)烈丁香氣味，微溶于水，易溶于乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等有機(jī)溶劑[4]。研究表明，丁香酚不但具有廣譜的抑菌活性和殺菌活性，而且還具有一定的鎮(zhèn)靜麻醉、抗炎及抗氧化等功效[5]； 同時(shí)，由于其毒副作用小、不易殘留等特點(diǎn)，有學(xué)者認(rèn)為其有望成為一種新型的天然抑菌劑。通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)多種致病菌株均有一定抑制作用，如鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7]、金黃色葡萄球(Staphylococcusaureus)[8]等，但目前關(guān)于丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌抑菌作用的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以維氏氣單胞菌為供試菌，通過研究丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌作用，以及丁香酚在低濃度下對(duì)該菌株生物被膜形成能力、運(yùn)動(dòng)性、脂肪酶活性及蛋白酶活性的影響來探討丁香酚的抑菌機(jī)理，以期為丁香酚用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌疾病提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 維氏氣單胞菌TH0426株(分離于患病的黃顙魚體內(nèi))，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室保存。

1.2 主要試劑與儀器 丁香酚(純度≥99%)，購自上海麥克林生化科技有限公司；偶氮酪蛋白，購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；三氯乙酸、氫氧化鈉，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMSO、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)、PBS、吐溫80、氯霉素溶液、結(jié)晶紫，均購自北京索萊寶科技有限公司；低溫高速離心機(jī)，購自德國(guó)Sigma公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌液制備 將本實(shí)驗(yàn)室凍干保存的維氏氣單胞菌接種至LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，采用無菌接種環(huán)蘸取活化后的菌液劃線于RS固體平板中，28 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)；挑取板上生長(zhǎng)的單菌落接種至含液體LB的10 mL試管中，28 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，并將其梯度稀釋至1×106～1×109CFU/mL，于4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌活性的測(cè)定 抑菌活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[6]所述方法并略作改進(jìn)。稱取6.4 mg丁香酚溶于DMSO中，并用LB液體培養(yǎng)基配置成質(zhì)量濃度為6 400 μg/mL的母液以備用，后續(xù)試驗(yàn)所需系列濃度均以此母液稀釋配置所得。吸取200 μL濃度為1×108CFU/mL的菌液均勻涂布于固體LB平板中，用無菌的牛津杯在平板上打3個(gè)孔再對(duì)其封底。待底部凝固后，向1號(hào)孔中加入150 μL丁香酚母溶液，2號(hào)孔中加入150 μL的1% DMSO溶液為溶劑對(duì)照，為比較分析丁香酚與維氏氣單胞菌敏感性抗生素的抑菌差異性[9]，向3號(hào)孔中加入150 μL質(zhì)量濃度為200 μg/mL的氯霉素溶液為對(duì)比試驗(yàn)，隨后將平板置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)。每次試驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。抑菌效果參照文獻(xiàn)[10]中的標(biāo)準(zhǔn)判定，即抑菌圈直徑>20 mm為極度敏感；15～20 mm為高度敏感；10～15 mm為中度敏感；<10 mm為低度敏感。

1.3.3 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 根據(jù)微量二倍稀釋法[11]檢測(cè)丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度。預(yù)先于96孔培養(yǎng)板中加入100 μL濃度為1×106CFU/mL的菌液，試驗(yàn)組加入100 μL丁香酚使其每孔的終濃度依次為3 200、1 600、800、400、200、100、50 μg/mL和25 μg/mL，空白對(duì)照組加入100 μL不含丁香酚的LB液體培養(yǎng)基，溶劑組則加入100 μL 的1% DMSO，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，充分混勻，置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值從而確定丁香酚的MIC值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最小殺菌濃度。從上述96孔板培養(yǎng)的菌懸液中各取100 μL培養(yǎng)物，接種至無菌的LB平板上，28 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，待培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)各平板中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況以判定 MBC值。

1.3.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 吸取濃度為1×108CFU/mL的菌液，將其按1%比例接種至含丁香酚(終濃度分別為800、400、200、100、50 μg/mL和25 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中；同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)基內(nèi)不添加丁香酚的空白對(duì)照組與添加等量1% DMSO的溶劑組，28 ℃、180 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24 h，期間每隔2 h取樣1次，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其在OD600值并記錄，以細(xì)菌培養(yǎng)的時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 生物被膜形成能力的測(cè)定 參照Tan等[12]所用的96孔板法檢測(cè)菌株生物被膜形成能力并適當(dāng)改進(jìn)，具體操作如下：將濃度為1×109CFU/mL的菌液按1%比例接種至含丁香酚(終濃度依次為200、100、50、25、12.5 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組及1% DMSO的溶劑組，充分混勻并吸取200 μL的混合液于無菌的96孔培養(yǎng)板中，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，吸凈孔中的液體，用無菌的PBS緩慢清洗3次后，置于溫箱中晾干；待晾干后，每孔加入200 μL的甲醇溶液固定20 min，吸棄甲醇，室溫晾干15 min；待干燥后，每孔加入1%結(jié)晶紫染液200 μL，染色30 min，棄去染液，用無菌雙蒸水清洗3次，每孔200 μL，吸棄雙蒸水后，輕甩培養(yǎng)板至其干燥。待完全干燥后，向各孔中加入200 μL的33%冰醋酸溶液并充分混勻，靜置10 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD575值，以判定菌株的生物被膜形成能力。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13]所述方法并略微調(diào)整，高壓滅菌含0.3%瓊脂的LB培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃后，試驗(yàn)組加入丁香酚使其終濃度分別為200、100、50、25、12.5 μg/mL和6.25 μg/mL，溶劑組加入等量的1% DMSO，空白對(duì)照組則為不含丁香酚的LB培養(yǎng)基，輕輕搖勻并倒入相同規(guī)格的平板，試驗(yàn)中為排除培養(yǎng)基體積所產(chǎn)生的誤差，需將培養(yǎng)基在試管中配置(20 mL/管)。待培養(yǎng)基凝固以后，分別吸取2 μL濃度為1×107CFU/mL的菌液接種至培養(yǎng)基表面，28 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間平板勿晃動(dòng)，待培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量各菌落直徑，菌落直徑大小與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力呈正相關(guān)。試驗(yàn)中每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 脂肪酶活性的測(cè)定 根據(jù)Yang等[14]所述方法，檢測(cè)丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌脂肪酶活性的影響。高壓滅菌含1.5%瓊脂和含1%吐溫80的LB培養(yǎng)基，待其冷卻至50 ℃后，試驗(yàn)組加入丁香酚(藥物濃度同1.3.7)，溶劑組加入等量的1% DMSO，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，輕輕混勻后并倒入平板。待凝固后，吸取2 μL濃度為1×107CFU/mL的菌液接種至平板正中央，28 ℃溫箱靜置培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)結(jié)束后分別測(cè)量各組中菌落直徑和其外圈沉淀環(huán)直徑，外圈沉淀環(huán)直徑與菌落直徑的比值即為脂肪酶活性的大小。試驗(yàn)中每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9 蛋白酶活性的測(cè)定 蛋白酶活性的檢測(cè)結(jié)合文獻(xiàn)[15]的方法并稍作改進(jìn)。吸取濃度為1×107CFU/mL的菌液按1%比例接種至含丁香酚(終濃度依次為200、100、50、25、12.5 μg/mL和6.25 μg/mL) 的LB液體培養(yǎng)基中；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組及1% DMSO的溶劑組，28 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)36 h后收集培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物于4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，吸取上清液，并經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌以獲得胞外產(chǎn)物。分別吸取150 μL上述不同組的產(chǎn)物于2 mL的無菌EP管中，向管中加入1 mL的0.3%偶氮酪蛋白溶液，而后用旋渦振蕩器混勻再置于37 ℃水浴鍋中培養(yǎng)30 min，待培養(yǎng)結(jié)束后立即向管中加入10%的三氯乙酸溶液500 μL以終止反應(yīng)，室溫下靜置10 min 后，于4 ℃下離心10 min，吸取上清液100 μL轉(zhuǎn)接到96孔板中(每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔)，最后向各孔中加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液100 μL，于酶標(biāo)儀中震蕩10 s后讀取其OD400值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用軟件SPSS Statistics 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示，并使用單因素方差分析和Duncan新復(fù)極差法在P=0.05水平上進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌活性 抑菌活性的試驗(yàn)結(jié)果如中插彩版圖1所示，當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL時(shí)，其抑菌圈的直徑為(20.32±0.8) mm(1號(hào)孔，極度敏感)；1% DMSO溶液無抑菌圈產(chǎn)生(2號(hào)孔，不敏感)，這也表明以DMSO溶液作為丁香酚的助溶劑對(duì)其抑菌效果無影響；對(duì)照組氯霉素溶液的抑菌圈直徑為(30.85±0.78)mm(3號(hào)孔，極度敏感)。

2.2 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度(MIC) 由酶標(biāo)儀檢測(cè)溶劑組(DMSO)和空白對(duì)照組(Contol)的OD值無顯著差異(P>0.05)可知，溶劑組的菌體生長(zhǎng)狀態(tài)和空白對(duì)照組基本無差別，因此，可忽略丁香酚的助溶劑(1% DMSO)對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響。當(dāng)丁香酚濃度大于400 μg/mL時(shí)，28 ℃下培養(yǎng)24 h后，孔中培養(yǎng)液仍澄清透明，即維氏氣單胞菌沒有生長(zhǎng)，因此，丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的MIC為400 μg/mL(圖2)。

圖2 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度Fig.2 Minimum inhibitory concentration of eugenol against Aeromonas veronii注：不同小寫字母表示組間差異顯著，P<0.05；下圖同Note:Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05. The same as below

2.3 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最小殺菌濃度(MBC) 通過最小殺菌濃度試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香酚濃度為800 μg/mL時(shí)，維氏氣單胞菌在平板中不生長(zhǎng)，而丁香酚濃度為400 μg/mL時(shí)，其在板中生長(zhǎng)狀態(tài)良好。根據(jù)《食品中抗菌藥物殘留的化學(xué)分析》[16]，以無菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)，因此丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的MBC為800 μg/mL。

2.4 不同濃度的丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示，溶劑組(DMSO)與空白對(duì)照組(Contol)生長(zhǎng)曲線基本重合，二者在生長(zhǎng)能力上無顯著差異(P>0.05)。當(dāng)丁香酚濃度小于50 μg/mL，其對(duì)維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)無顯著影響(P>0.05)，此時(shí)菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)同空白對(duì)照組，它們具有相似的遲緩期、對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期；丁香酚濃度大于100 μg/mL時(shí)，其顯著抑制了維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)(P<0.05)，此時(shí)菌株的生長(zhǎng)速率較空白組而言相對(duì)減緩，且在穩(wěn)定期時(shí)的OD值明顯下降；丁香酚濃度大于800 μg/mL時(shí)，維氏氣單胞菌不生長(zhǎng)(見中插彩版圖3)。

2.5 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌生物被膜形成能力的影響 結(jié)合酶標(biāo)儀所測(cè)OD575值，對(duì)菌株生物被膜形成量比較分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香酚濃度大于100 μg/mL時(shí)，其顯著抑制了維氏氣單胞菌生物被膜的形成(P<0.05)；丁香酚濃度小于50 μg/mL時(shí)，其顯著促進(jìn)了維氏氣單胞菌生物被膜形成(P<0.05)，且丁香酚濃度越低，促進(jìn)作用越明顯(圖4)。

圖4 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌生物被膜形成的影響Fig.4 Effects of eugenol on biofilm formation of Aeromonas veronii

2.6 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌運(yùn)動(dòng)性的影響 在運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)中，通過測(cè)量菌落直徑可得知，當(dāng)丁香酚濃度大于25 μg/mL時(shí)，其顯著抑制了維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)性(P<0.05)，且丁香酚濃度越高，抑制作用越顯著；丁香酚濃度小于12.5 μg/mL時(shí)，其對(duì)維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)性無顯著影響(P>0.05，圖5)。

圖5 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌運(yùn)動(dòng)性的影響Fig.5 Effects of eugenol on the motility of Aeromonas veronii

2.7 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌脂肪酶活性的影響 利用含1%吐溫80的LB板對(duì)脂肪酶活性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香酚濃度為200 μg/mL時(shí)，其顯著抑制了維氏氣單胞菌的脂肪酶活性(P<0.05)；丁香酚濃度小于100 μg/mL時(shí)，其對(duì)維氏氣單胞菌的脂肪酶活性無顯著影響(P>0.05，圖6)。

2.8 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌蛋白酶活性的影響 蛋白酶活性的檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的丁香酚均可顯著性地抑制維氏氣單胞菌的蛋白酶活性(P<0.05)，當(dāng)丁香酚濃度為200 μg/mL時(shí)，其對(duì)維氏氣單胞菌蛋白酶活性的抑制作用最明顯(圖7)。

圖6 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌脂肪酶活性的影響Fig.6 Effects of eugenol on the lipase activity of Aeromonas veronii

圖7 丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌蛋白酶活性的影響Fig.7 Effects of eugenol on the protease activity of Aeromonas veronii

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害愈發(fā)嚴(yán)重，因此大量的抗生素類藥物被廣泛用于防治水產(chǎn)致病菌。然而，抗生素類藥物在初次使用時(shí)效果極佳，但隨著普遍地用藥以及藥量的加大會(huì)致使病原菌產(chǎn)生耐藥性；此外由于抗生素在環(huán)境中可持久殘留，其還給水產(chǎn)品及水體質(zhì)量造成影響，因此，尋找一種安全無毒且不易產(chǎn)生耐藥的抗菌藥物以治療水產(chǎn)病原菌具有重要意義。近年來，中草藥及其提取物被用于水產(chǎn)動(dòng)物病害防治的報(bào)道不斷出現(xiàn)，并且作為后抗生素的使用逐漸得以替代，因此頗受研究學(xué)者的重視。丁香酚作為一種天然無污染的植物提取物，因其抑菌效果好、安全性高、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。

本試驗(yàn)通過丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL時(shí)，維氏氣單胞菌對(duì)丁香酚表現(xiàn)為極度敏感，即該濃度的丁香酚對(duì)該致病菌具有良好的抑菌作用。MIC及MBC試驗(yàn)結(jié)果表明，丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌TH0426株的MIC值為400 μg/mL、MBC值為800 μg/mL，而Bandeira等[11]研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)銀魚源維氏氣單菌的MIC和MBC分別為800 μg/mL和1 600 μg/mL，其與本試驗(yàn)結(jié)果不相同，因此我們認(rèn)為丁香酚對(duì)于不同來源菌株的抑菌效果也會(huì)有所不同。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示，丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)有抑制作用，而且其對(duì)菌株的抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，當(dāng)丁香酚濃度大于100 μg/mL時(shí)，菌株生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，并且其遲緩期的時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，這說明丁香酚有效地抑制了維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)?，F(xiàn)有研究表明，丁香酚通過作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的酶活性或功能蛋白，影響細(xì)胞代謝，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[8]；還有研究認(rèn)為丁香酚通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜而達(dá)到抑菌效果[17]，鑒于目前有關(guān)丁香酚抑菌機(jī)理的說法尚未統(tǒng)一，所以其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探究。

研究表明，維氏氣單胞菌的致病性強(qiáng)弱與其分泌、表達(dá)的多種毒力因子密切相關(guān)，如外毒素、粘附因子(菌毛、鞭毛)、胞外產(chǎn)物(脂肪酶、蛋白酶)等[18]，而細(xì)菌在侵襲、感染宿主的過程中往往需要多種毒力因子相互協(xié)同發(fā)揮致病作用。鑒于高濃度的抑菌藥物對(duì)細(xì)菌耐藥的選擇壓力大[19]，因此，本試驗(yàn)開展了低濃度的丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌生物被膜形成能力、運(yùn)動(dòng)性、脂肪酶活性及蛋白酶活性等毒力作用的試驗(yàn)，擬通過丁香酚干擾維氏氣單胞菌致病能力，從而起到防控該致病菌感染的目的。生物被膜是細(xì)菌在繁殖過程中，免受抗菌藥物及宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的一種保護(hù)形式。通過測(cè)定菌株的生物被膜時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香酚濃度大于100 μg/mL 時(shí)，其能有效地抑制維氏氣單胞菌生物被膜的形成，而丁香酚濃度小于50 μg/mL時(shí)，其能有效促進(jìn)菌株生物被膜的形成，而我們認(rèn)為丁香酚是通過抑制菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制其生物被膜的形成；前期通過測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香酚濃度小于50 μg/mL時(shí)，其對(duì)菌株的生長(zhǎng)無影響，所以該濃度范圍內(nèi)，丁香酚對(duì)其生物被膜并不產(chǎn)生抑制作用，但其是如何刺激菌株生物被膜的形成，具體機(jī)制尚未清楚，仍需進(jìn)一步研究。運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果表明，丁香酚濃度大于25 μg/mL時(shí)，其能有效地降低維氏氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力，通過文獻(xiàn)得知[18]鞭毛可介導(dǎo)氣單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力，所以猜測(cè)丁香酚可能是破壞了菌株的鞭毛結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)能力大幅降低。胞外產(chǎn)物是病原菌的重要致病因子，其通過降解宿主的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等引起宿主組織損傷，從而利于病原菌入侵宿主體內(nèi)發(fā)揮致病作用。通過丁香酚作用于維氏氣單胞菌的脂肪酶和蛋白酶的試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其脂肪酶和蛋白酶的活性均有降低，與空白對(duì)照組相比，尤其是蛋白酶活性有顯著差異。綜上所述，我們初步預(yù)判丁香酚作用機(jī)理是其通過影響細(xì)菌中的粘附因子、胞外產(chǎn)物等一些毒力因子，從而起到抑菌作用。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果可知，丁香酚對(duì)維氏氣單胞菌具有一定的抑菌和殺菌效果，而且低濃度的丁香酚對(duì)該菌株的部分毒力因子具有抑制作用，但其抑制作用有限；然而考慮到藥物在發(fā)揮抑菌作用時(shí)，不是單純地作用于病原菌，其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物本身也具有一定影響，所以恰當(dāng)?shù)乃幬餄舛葘?duì)于防控細(xì)菌的感染至關(guān)重要，而低濃度的丁香酚能否用于防治水產(chǎn)維氏氣單胞菌，仍需應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中以驗(yàn)證效果。本試驗(yàn)所得結(jié)果，可供丁香酚在漁業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考，并為丁香酚在漁業(yè)生產(chǎn)中制定給藥方案、合理用藥提供一定理論依據(jù)。