馬震原， 閆若潛， 趙雪麗， 謝彩華， 曹偉偉， 王淑娟， 王東方， 王華俊， 王 翠

(河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 河南鄭州450008)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD) 是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的以偶蹄動(dòng)物感染為主的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病傳播快，傳染性強(qiáng)，暴發(fā)時(shí)可給世界范圍畜牧業(yè)造成嚴(yán)重危害。因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE) 將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病的首位[2]。我國(guó)也將其列為一類(lèi)重大動(dòng)物疫病。FMDV病原變異大，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有7個(gè)血清型[3]，而我國(guó)主要受O、A型及AsiaⅠ型3種血清型的威脅[4]。FMDV各血清型之間無(wú)交叉免疫性，同一血清型內(nèi)的不同亞型之間也只有部分有交叉免疫性[5]。因此，對(duì)FMDV的快速檢測(cè)及血清型鑒定是有效控制該病流行的關(guān)鍵。

不同血清型FMDV感染的臨床癥狀難以被區(qū)分，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難準(zhǔn)確判斷[6-7]。目前，常用于FMDV檢測(cè)的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 和分子生物學(xué)檢測(cè)方法等。而ELISA目前只能用于評(píng)價(jià)口蹄疫單一血清型的抗體水平[8-9]，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同血清型抗原進(jìn)行鑒別檢測(cè)。普通RT-PCR方法具有快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，不依賴(lài)于價(jià)格昂貴的儀器，可在基層疫病病原學(xué)檢測(cè)中廣泛實(shí)踐應(yīng)用。本試驗(yàn)針對(duì)O型、A型與AsiaⅠ型3種血清型設(shè)計(jì)特異性引物，建立FMDV O型、A型與AsiaⅠ型三重RT-PCR檢測(cè)方法，直接對(duì)3種血清型進(jìn)行鑒定，方法快速、特異、準(zhǔn)確，為臨床中有效準(zhǔn)確地對(duì)FMDV快速分型提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株 經(jīng)滅活的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物，購(gòu)自國(guó)內(nèi)某單位生產(chǎn)的口蹄疫檢測(cè)試劑盒；經(jīng)滅活的豬水皰病病毒(SVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬附紅細(xì)胞體(Eperythrozoonsuis)及豬弓形蟲(chóng)(Toxoplasmosis)等毒株及正常BHK-21細(xì)胞株，均由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.2 儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biomotra公司產(chǎn)品；Kingfishier全自動(dòng)核酸提取儀，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)AIpha Innotech 公司產(chǎn)品；恒溫水浴振蕩器(HZQ-Q)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品；ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T Easy載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自Promega公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 以FMDV O型、A型和AsiaⅠ型均高度保守的2B基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物P0，根據(jù)VP1基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，分別命名為P1/P2、P3/P4、P5/P6，由寶生物工程(大連)有限公司合成，擴(kuò)增出的片段大小分別為234 bp、326 bp和467 bp。

1.4 樣品核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄 磁珠法提取經(jīng)滅活的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物、正常BHK-21細(xì)胞、SVDV、PRRSV、CSFV 樣品的總RNA和PRV、PPV、Eperythrozoonsuis、Toxoplasmosis樣品的總DNA。提取樣本總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，其cDNA置于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化，以經(jīng)滅活的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物等量混合物cDNA為模板進(jìn)行三重RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)正常BHK-21細(xì)胞cDNA 為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后克隆入pGEM-T Easy載體，送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物cDNA根據(jù)濃度成比列混合，每種cDNA的終濃度為1.0×107拷貝/μL，以10倍系列稀釋濃度為1.0×107～1.0×100拷貝/μL的混合cDNA為模板，同時(shí)設(shè)正常BHK-21細(xì)胞cDNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行敏感性檢測(cè)。

1.7 特異性試驗(yàn) 以SVDV、PRRSV、CSFV樣品cDNA和PRV、PPV、豬附紅細(xì)胞體及豬弓形蟲(chóng)樣品DNA，同時(shí)設(shè)經(jīng)滅活的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物等量混合物cDNA為陽(yáng)性對(duì)照，正常BHK-21細(xì)胞cDNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 以1.6敏感性試驗(yàn)的系列稀釋濃度cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)系列重復(fù)3次試驗(yàn)，以驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.9 臨床應(yīng)用試驗(yàn) 由具備國(guó)內(nèi)口蹄疫病毒分離培養(yǎng)研究資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室以本試驗(yàn)建立的三重RT-PCR方法對(duì)其保存的10 份臨床疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與其之前的分離鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，同1.7特異性試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法的建立 以經(jīng)滅活的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株等量細(xì)胞培養(yǎng)液混合物cDNA為模板，擴(kuò)增出了3條預(yù)期大小的目的條帶，分別為234 bp、326 bp和467 bp；以單一標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)液RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，均能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶；陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶(見(jiàn)圖1)。將3條不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy載體進(jìn)行測(cè)序，與GenBank中已登錄序列進(jìn)行比對(duì)，3種血清型O型、A型和AsiaⅠ型擴(kuò)增片段核苷酸序列同源性均達(dá)98%以上。

2.2 敏感性試驗(yàn) FMDV三種血清型O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞培養(yǎng)物cDNA最低檢測(cè)限均為100 拷貝/μL，均出現(xiàn)大小為234 bp、326 bp和467 bp 左右的目的條帶(見(jiàn)圖2)，表明本試驗(yàn)建立的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法的最低檢測(cè)限度為100 拷貝/μL。

2.3 特異性試驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出234 bp、326 bp和 467 bp 三條目的條帶，而陰性對(duì)照、 SVDV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、Eperythrozoonsuis、Toxoplasmosis樣品均未擴(kuò)增出任何條帶(見(jiàn)圖3)。

圖1 FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Identification result of RT-PCR for serotype O，A and AsiaⅠ FMDVM:DL-2 000 DNA marker； 1: FMDV O型、A型和AsiaⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株等量細(xì)胞培養(yǎng)液混合物； 2: FMDV O型培養(yǎng)物； 3: FMDV A型培養(yǎng)物； 4: FMDV AsiaⅠ型培養(yǎng)物； 5:陰性對(duì)照M: DL-2 000 DNA marker； 1: Mixture of serotype O, A and AsiaⅠ FMDV standard strain infected cell culture； 2: Serotype O FMDV standard strain infected cell culture； 3: Serotype A FMDV standard strain infected cell culture； 4: Serotype AsiaⅠ FMDV standard strain infected cell culture； 5: Negative control

圖2 FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法敏感性試驗(yàn)擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Analysis of sensitivity test of RT-PCR for serotype O，A and AsiaⅠ FMDVM：DL-2 000 DNA marker； 1～7：10倍系列稀釋的濃度均為1.0×107～1.0×100 拷貝/μL的FMDV三種血清型O型、A型和AsiaⅠ型培養(yǎng)物混合物M：DL-2 000 DNA marker； 1～7：Mixture serotype of O, A and AsiaⅠ FMDV plasmids in concentration of 1.0×107 ～1.0×100 copies/μL

2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 濃度為1.0×107～1.0×102拷貝/μL模板的3次重復(fù)擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性；濃度為1.0×101～1.0×100拷貝/μL模板的3次重復(fù)結(jié)果均為陰性。表明本試驗(yàn)建立的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

2.5 臨床應(yīng)用試驗(yàn) 對(duì)10份臨床疑似樣品株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為口蹄疫O型陽(yáng)性樣本4份、口蹄疫型A型陽(yáng)性樣本1份、口蹄疫AsiaⅠ型陽(yáng)性樣本3份、陰性樣本2份(見(jiàn)圖4)。此檢測(cè)結(jié)果與以前的分離鑒定結(jié)果符合率為100%。

圖3 FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法特異性試驗(yàn)擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Analysis of specificity of RT-PCR for serotype O，A and AsiaⅠFMDVM：DL-2 000 DNA marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照； 2：陰性對(duì)照； 3～9：SVDV, PRRSV, CSFV, PRV, PPV, Eperythrozoon suis and ToxoplasmosisM：DL-2 000 DNA marker； 1：Positive control； 2：Negative control； 3～9：SVDV, PRRSV, CSFV, PRV, PPV, Eperythrozoon suis and Toxoplasmosis

3 討論

我國(guó)是口蹄疫多發(fā)區(qū)，流行毒株種類(lèi)較多。O型口蹄疫幾乎每年都會(huì)發(fā)生，而且波及范圍較廣泛；AsiaⅠ型在多個(gè)省份出現(xiàn)過(guò)疫情，已經(jīng)報(bào)告有豬感染后死亡的病例；A型從2009年初至今，已有多個(gè)省份發(fā)生，涉及到牛和羊。當(dāng)前我國(guó)不僅面臨FMDV毒株繁多、血清型復(fù)雜的嚴(yán)峻形勢(shì)，而且各亞型毒株在豬群中共感染，導(dǎo)致發(fā)病率與死亡率增高、免疫失敗散發(fā)，使防控難度大大增加。因此，對(duì)FMDV的快速分型檢測(cè)是控制疫情的有效手段，也是科學(xué)免疫的必要前提。目前，只有分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)可以滿(mǎn)足快速準(zhǔn)確地進(jìn)行抗原分型的要求，同時(shí)可檢測(cè)到滅活病毒的核酸，較大程度地提高了檢測(cè)工作的安全性[10]。

圖4 FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法臨床樣本檢測(cè)電泳圖Fig.4 Clinical test of RT-PCR for serotype O，A and AsiaⅠ FMDVM：DL-2 000 DNA marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照； 2：陰性對(duì)照； 3～12：10份臨床疑似樣品M：DL-2 000 DNA marker； 1：Positive control； 2：Negative control； 3～12：10 suspected clinical samples

FMDV主要的非結(jié)構(gòu)蛋白和保守序列主要包括2B、3D和IRES 等[11]。同源性分析顯示，2B區(qū)最為保守，同源性為 87.7%～95.2%；其次是 3C，第三是 3D[12]。同時(shí)有研究者發(fā)現(xiàn)，以2B為模板建立的RT-PCR方法敏感性更高[13]。因此，本試驗(yàn)建立的FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法選取高度保守的2B基因區(qū)域設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)3種血清型病毒核酸反轉(zhuǎn)錄均能得到各自特異的cDNA。 本方法設(shè)計(jì)的3對(duì)型特異性引物是以FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1為目的區(qū)域。因?yàn)樵摰鞍孜挥诓《疽職け砻?，是決定FMDV抗原性的主要蛋白；同時(shí)VP1是能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體的唯一蛋白，臨床上合成肽疫苗的選擇區(qū)域來(lái)源于VP1上在129～169 負(fù)責(zé)保護(hù)性免疫的氨基酸區(qū)域；而不同血清型的VP1蛋白同源性?xún)H有約60%[14-15]，這恰好為鑒別不同血清型提供了特異性基因區(qū)域的要求。本試驗(yàn)建立的鑒別FMDV O型、A型和AsiaⅠ型三重RT-PCR方法選擇VP1基因上不同區(qū)域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)特異性引物，不存在交叉反應(yīng)，擴(kuò)增條帶分別為234、326 bp和467 bp，條帶特異清晰，通過(guò)一次PCR反應(yīng)就能達(dá)到較好的血清型分型效果。

通過(guò)對(duì)不同稀釋度的3種血清型樣品cDNA混合物進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證得到本方法的最低檢測(cè)限度達(dá)到100 拷貝/μL，敏感性較高，可從較大程度上減少漏檢的可能，并能夠更好地檢出隱性感染病原體。本試驗(yàn)建立的方法與臨床上常與FMDV混合感染或臨床癥狀難以區(qū)分的病原核酸無(wú)任何交叉反應(yīng)，說(shuō)明本方法具有較好的特異性，能夠準(zhǔn)確地應(yīng)用于FMDV的臨床檢測(cè)，對(duì)FMD綜合防控具有重要的意義。