賀博 王寧 鄧繁艷 富靈杰 寧聰琴

摘 ?要： 理想的骨再生材料需要具有良好的生物活性和力學(xué)強(qiáng)度.前期的研究表明硅磷酸鈣（Ca5（PO4）2SiO4，CPS）陶瓷具有良好的生物活性，可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并在體內(nèi)可促進(jìn)新骨的形成.研究了α-氮化硅（α-Si3N4）對(duì)CPS生物陶瓷顯微結(jié)構(gòu)、抗彎強(qiáng)度、體外磷灰石形成能力及細(xì)胞相容性的影響.結(jié)果表明：α-Si3N4的添加可在一定程度上提高CPS生物陶瓷的抗彎強(qiáng)度，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，Si3N4-CPS陶瓷的抗彎強(qiáng)度為相同溫度下純CPS陶瓷的1.2倍.模擬體液浸泡實(shí)驗(yàn)表明：Si3N4-CPS生物陶瓷均具有良好的磷灰石形成能力.CCK-8細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Si3N4-CPS生物陶瓷無明顯細(xì)胞毒性，展示出良好的生物相容性.

關(guān)鍵詞： 硅磷酸鈣（CPS）; α-氮化硅（α-Si3N4）; 抗彎強(qiáng)度; 磷灰石形成能力; 生物相容性

中圖分類號(hào)： ?O 611.6 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? ?文章編號(hào)： 1000-5137（2021）06-0688-09

Abstract： Ideal bone regeneration materials should have good biological activity and mechanical strength. Previous studies have shown that silicocarnotite （Ca5（PO4）2SiO4， CPS） bioceramic has good biological activity， which can induce osteogenic differentiation of bone marrow matrix stem cells and promote the formation of new bones in vivo. This paper investigated the effects of α-silicon nitride （α-Si3N4） on microstructure， bend strength， apatite forming ability and cytocompatibility of CPS bioceramic. The results show that the addition of α-Si3N4 can improve the bending strength of CPS bioceramic to some extent， and when its mass fraction is 1.5 %， the bending strength of Si3N4-CPS ceramic is 1.2 times of that of pure CPS ceramic at the same sintering temperature. The simulation body fluid immersion experiment shows that Si3N4-CPS bioceramic has good apatite forming ability. The experimental results of CCK-8 cytocompatibility test show that Si3N4-CPS bioceramic has no obvious cytotoxicity， exhibiting a good biocompatibility.

Key words： silicocarnotite（CPS）; α-silicon nitride （α-Si3N4）; bending strength; apatite formation ability; biocompatibility

0 ?引 言

生物陶瓷是修復(fù)和重建患病或受損骨組織的常用材料[1].在過去的幾十年里，磷酸鈣類生物陶瓷，如羥基磷灰石（Ca10（PO4）6（OH）2，HA）陶瓷和磷酸鈣（Ca3（PO4）2，TCP）陶瓷，因其良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，成為最受歡迎的人工骨材料[2].20世紀(jì)70年代初，CARLISLE[3]發(fā)現(xiàn)了硅（Si）是骨鈣化的重要因素，MOTISUKE等[4]也發(fā)現(xiàn)含Si的生物玻璃具有良好的生物活性，其在生理溶液中具有優(yōu)異的誘導(dǎo)骨狀磷灰石形成的能力，在體內(nèi)可誘導(dǎo)新骨的生成，并與周圍宿主組織形成骨性結(jié)合.自此，含Si的生物玻璃和生物陶瓷得到了特別的關(guān)注[5-6].為了結(jié)合TCP陶瓷和Si元素的優(yōu)點(diǎn)，有研究將Si摻入磷酸鈣陶瓷中，制備了摻硅磷酸鈣（CPS）陶瓷，如Si-HA和Si-TCP，Si的摻入可明顯促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨分化[7].

作為含Si的磷酸鈣陶瓷，具有正交結(jié)構(gòu)的Ca5（PO4）2SiO4材料近年來受到了關(guān)注.BALAS等[8]利用四水合硝酸鈣（Ca（NO3）2·4H2O）、磷酸（H3PO4）和二氧化硅（SiO2）溶膠分別作為鈣（Ca）、磷（P）和Si源得到了純CPS.此外，有報(bào)道將磷酸鈣/硅酸鈣（Ca3（PO4）2/Ca2SiO4）為反應(yīng)原料制備出了純相CPS粉體，發(fā)現(xiàn)模擬體液（SBF）浸泡后有磷灰石生成，說明其具有良好的體外磷灰石沉積能力[9].在其他合成方法中，BULINA等[10]利用機(jī)械化學(xué)合成的方法，制備出了CPS粉體.在CPS材料的晶體結(jié)構(gòu)方面，ANDREEV等[11]也對(duì)其進(jìn)行固態(tài)核磁共振和計(jì)算的研究.本課題組前期利用溶膠-凝膠法合成了純相CPS粉體，發(fā)現(xiàn)與HA陶瓷相比，CPS陶瓷具有更好的生物活性，不僅具有良好的磷灰石形成能力，還能顯著促進(jìn)大鼠骨髓干細(xì)胞（rBMSC）的成骨分化[12-13]，且在體內(nèi)亦具有更好的成骨活性和可降解性，植入12周后，CPS材料降解率可達(dá)41.8%[14].由于Si的加入，CPS支架具有較好的體內(nèi)降解能力，同時(shí)Ca和P組分的降解可為新骨的生長(zhǎng)提供Ca和P的來源，從而加速骨再生過程[12，15].此外，將CPS粉體植入腱-骨傷口處的實(shí)驗(yàn)還表明，其可以明顯促進(jìn)腱-骨愈合過程[16].然而，溶膠-凝膠法制備的CPS粉體燒結(jié)性能差，導(dǎo)致其力學(xué)強(qiáng)度低，從而限制其進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化.

氮化硅（Si3N4）是一種以高性能著稱的結(jié)構(gòu)陶瓷，其具有高斷裂韌性、高耐磨性和低摩擦系數(shù).GUEDES等[17]將Si3N4片植入到兔子的股骨中，發(fā)現(xiàn)無不良細(xì)胞反應(yīng)發(fā)生，并證明了其與周圍骨組織有良好的界面結(jié)合.且Si3N4也被發(fā)現(xiàn)能上調(diào)成骨細(xì)胞的代謝活性[18].將Si3N4用作β-CaSiO3陶瓷的燒結(jié)助劑，發(fā)現(xiàn)添加Si3N4后β-CaSiO3陶瓷的彎曲強(qiáng)度得到了顯著提升[19].AMARAL等[20]對(duì)Si3N4-生物玻璃復(fù)合材料進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合物不僅能促進(jìn)人骨髓細(xì)胞的增殖和分化，還有助于材料實(shí)現(xiàn)更快的骨整合.

為了提高CPS材料的力學(xué)強(qiáng)度和生物活性，本文作者引入了具有良好力學(xué)特性的Si3N4材料來調(diào)控CPS的綜合性能，探究α-氮化硅（α-Si3N4）的添加對(duì)CPS生物陶瓷的力學(xué)強(qiáng)度和生物活性的影響.

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料的制備與表征

CPS粉體制備：采用Ca（NO3）2·4H2O（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑集團(tuán)公司）、磷酸三乙酯（TEP，化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑集團(tuán)公司）和正硅酸乙酯（TEOS，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑集團(tuán)公司）分別作為Ca源、P源和Si源.合成步驟簡(jiǎn)述如下：將適量的TEOS在室溫下與一定量2 mol·L-1硝酸、去離子水和無水乙醇攪拌1 h，使其充分水解，之后按化學(xué)計(jì)量比加入TEP，攪拌2 h后加入Ca（NO3）2·4H2O繼續(xù)攪拌3 h，使其完全溶解，得到澄清的溶膠，隨后置于60 ℃烘箱陳化3 d，再在120 ℃烘箱中干燥得到干凝膠.將干凝膠研磨篩分后于1 350 ℃下煅燒6 h得到CPS粉體，過200目篩備用.

Si3N4-CPS陶瓷制備：所用α-Si3N4粉體（α相質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥92%，平均粒徑約為420 nm）采購自江蘇安塞美新能源科技有限公司.將α-Si3N4粉體按照0，0.5%，1.0%，1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的比例與上述制備得到的CPS粉體采用機(jī)械球磨的方法混合（以下簡(jiǎn)稱CPS，0.5 Si3N4-CPS，1.0 Si3N4-CPS，1.5 Si3N4-CPS）.將混合粉體壓制成塊狀（21 mm×27 mm×6 mm）和圓片狀（直徑為10 mm，厚度為2 mm）試樣，在253 MPa壓力下等靜壓處理，隨后在1 300 ℃燒結(jié)2 h，并隨爐冷卻.

1.2 相成分及顯微結(jié)構(gòu)表征

用X射線衍射儀（XRD， Rigaku， Ultima IV）檢測(cè)原材料粉體及Si3N4-CPS陶瓷的物相組成.測(cè)試時(shí)選用Cu Kα射線（波長(zhǎng)為1.541 8×10-10 m），步長(zhǎng)0.02°，掃描速度5（°）·min-1，掃描范圍20°～50°.

用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM，Magellan 400，F(xiàn)EI）觀察原材料及Si3N4-CPS陶瓷的的形貌，并利用其配備的能譜儀對(duì)Si3N4-CPS陶瓷的成分進(jìn)行分析.

所制備的CPS粉體和采購的α-Si3N4粉體的物相和形貌，分別如圖1和圖2所示.由圖1可見，所制備的CPS粉體物相與PDF#40-0393相吻合，無明顯雜相衍射峰.由圖2可見，其形貌為不規(guī)則的顆粒狀，α-Si3N4粉體物相與PDF#09-0250符合良好，尺寸較為均勻.

1.3 抗彎強(qiáng)度測(cè)試

抗彎強(qiáng)度采用三點(diǎn)彎曲法在萬能材料試驗(yàn)機(jī)（Instron-5566，Instron Co.， Ltd.）上進(jìn)行測(cè)定.樣品尺寸為3.0 mm×4.0 mm×21.0 mm，力學(xué)測(cè)試底座跨度為16.0 mm，十字頭下降速度為0.5 mm·min-1，每組5個(gè)平行樣品.

1.4 開孔氣孔率測(cè)定

用阿基米德排水法進(jìn)行測(cè)定Si3N4-CPS陶瓷的開孔孔隙率.樣品的開孔氣孔率（S值）可表示為：

S=（m_2-m_1）/（m_2-m_3）×100%， （1）

其中，m1，m2和m3分別是樣品的干重、濕重和浮重.

1.5 SBF浸泡實(shí)驗(yàn)

材料在SBF中誘導(dǎo)磷灰石沉積的能力經(jīng)常被用來表征其體外生物活性.SBF的配制過程嚴(yán)格遵從 KOKUBO等[21]的方法，配置過程如下：將氯化鈉（NaCl）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、氯化鎂（MgCl2·6H2O）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鈉（Na2SO4）依次溶解在去離子水中，并用三羥甲基氨基甲烷（NH2C（CH2OH）3）和0.1 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值，使溶液在37 ℃時(shí)pH值為7.40，然后用容量瓶定容，低溫保存.

浸泡前，將制備的圓片狀樣品先后用無水乙醇和去離子水超聲清洗2遍，烘干后置15 mL的離心管中，按照陶瓷片表面積和SBF體積比為0.1 cm-1的比例，添加配制的SBF溶液后置于37 ℃的恒溫水浴振蕩箱中.分別在浸泡1，3和7 d后收集浸泡樣品后的SBF，并用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-OES Agilent 725， Agilent Technologies）測(cè)定其Ca，P和Si元素的濃度.浸泡7 d后，取出樣品，并用去離子水輕輕洗滌，60 ℃烘箱中干燥后用FE-SEM觀察其浸泡前后表面形貌和成分變化.

1.6 細(xì)胞相容性表征

將Si3N4-CPS陶瓷研磨，并過200目篩后加入50 mL離心管中，然后添加α-MEM培養(yǎng)基（200 mg·mL-1），之后在37 ℃恒溫振蕩箱中浸泡24 h.浸泡后的混合液經(jīng)離心機(jī)1 600 r·min-1分離10 min，收集上層清液，并經(jīng)0.22 μm過濾器過濾消毒后，加入10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胎牛血清（FBS，Gibco），100 U·mL-1的青霉素和100 U·mL-1的鏈霉素混合均勻待用.

采用Cell Counting Kit-8（CCK-8，Biotech）實(shí)驗(yàn)來評(píng)估材料的細(xì)胞相容性.所用的細(xì)胞為小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1（上海第九人民醫(yī)院）.按每孔100 μL MC3T3-E1細(xì)胞懸浮液（3.0×104 cell·mL-1）的量將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，然后在含有5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二氧化碳（CO2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換用已制備好的浸提液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，期間每2 d更換一次培養(yǎng)液.在培養(yǎng)不同時(shí)間后，用酶標(biāo)儀（Leica）分別測(cè)量溶液在450 nm和630 nm處的吸光度值（OD）.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方法表示，使用SPSS軟件和Graphpad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差分析.當(dāng)顯著性值（P值）小于0.05時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;當(dāng)P值小于0.01時(shí)，認(rèn)為有極顯著的差異.

2 ?結(jié)果與討論

2.1 Si3N4-CPS陶瓷的相成分、顯微結(jié)構(gòu)及其燒結(jié)性能

1 300 ℃燒結(jié)后的Si3N4-CPS陶瓷P值和抗彎強(qiáng)度隨Si3N4含量變化趨勢(shì)如圖3所示.可以看出，隨著Si3N4含量的增加，Si3N4-CPS陶瓷的P值降低，抗彎強(qiáng)度增加，這說明Si3N4的加入可促進(jìn)CPS陶瓷的燒結(jié).從圖3（a）可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Si3N4的含量從0增加到1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，其開孔孔隙率從26.2%下降到22.3%，其抗彎強(qiáng)度由47.5 MPa增加到55.2 MPa.1.5 Si3N4-CPS陶瓷燒結(jié)后的抗彎強(qiáng)度最高，可達(dá)55.2 MPa，是相同溫度下純CPS陶瓷抗彎強(qiáng)度的1.2倍左右，如圖3（b）所示.

圖4為1 300 ℃燒結(jié)后Si3N4-CPS陶瓷拋光表面的背散射電子像顯微（BSE）圖.可以看出，Si3N4-CPS陶瓷孔的數(shù)量明顯低于純CPS陶瓷，孔徑尺寸也有所減小.該結(jié)果與力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果一致.

Si3N4-CPS陶瓷在1 300 ℃下燒結(jié)2 h后的XRD結(jié)果如圖5所示.可以發(fā)現(xiàn)：Si3N4-CPS陶瓷在高溫?zé)Y(jié)后，其主相依舊是CPS，隨著Si3N4含量的增加，XRD圖中未發(fā)現(xiàn)Si3N4或其他雜相的存在.

為研究Si3N4-CPS陶瓷在高溫?zé)Y(jié)后的相組成，選擇在1 300 ℃下燒結(jié)后的0.5 Si3N4-CPS陶瓷樣品，對(duì)其拋光后進(jìn)行元素面掃分析，分析結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，Ca，P，O和N元素分布較為均勻，但有富Si相的存在，結(jié)合之前DENG等[22]的工作，可以推測(cè)此富Si相為硅酸鈣.但由于其含量較低，在XRD結(jié)果中，并未檢測(cè)到硅酸鈣的衍射峰.

2.2 Si3N4-CPS陶瓷體外磷灰石沉積能力

圖7為浸泡前后的Si3N4-CPS陶瓷片在FE-SEM下的表面形貌、元素含量和物相分析結(jié)果.從圖7（a）-7（d）可知，浸泡前Si3N4-CPS陶瓷片的表面較為疏松，有大量的孔洞存在，表面晶粒干凈且光滑.隨著Si3N4含量的增加，燒結(jié)后的Si3N4-CPS陶瓷在一定程度上顯示出致密化的趨勢(shì).圖7（e）-7（h）結(jié)果表明：在SBF中浸泡7 d后，Si3N4-CPS陶瓷表面與純CPS陶瓷表面一致，均覆蓋了一層連續(xù)且致密的沉積物.對(duì)沉積物進(jìn)一步放大觀察發(fā)現(xiàn)，表面沉積物主要由蠕蟲狀的晶粒構(gòu)成，為典型的類骨磷灰石形貌.

圖7（i）-7（l）和圖7（m）-7（p）為用SBF浸泡7 d后的Si3N4-CPS陶瓷表面能譜分析和XRD結(jié)果.能譜結(jié)果表明：Si3N4-CPS陶瓷表面形成的是一種缺鈣形磷灰石，其Ca和P的化學(xué)計(jì)量比在1.2～1.3左右.此外，隨著Si3N4含量的增加，能譜結(jié)果顯示出Si含量在一定程度上降低，這反映了Si3N4的添加能進(jìn)一步促進(jìn)CPS陶瓷表面沉積磷灰石的能力.XRD結(jié)果表明：浸泡后的Si3N4-CPS陶瓷的物相結(jié)晶性減弱，在26°出現(xiàn)了磷灰石的特征衍射峰，且隨著Si3N4含量的增加，此峰強(qiáng)度逐漸增加，進(jìn)一步說明Si3N4的摻雜提高了CPS陶瓷的磷灰石形成能力.可見，相比于純CPS，Si3N4-CPS陶瓷具有更好的體外生物活性.

圖8（a）-8（c）為Si3N4-CPS陶瓷圓片浸泡在SBF中Ca，P和Si的元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化曲線.采用趙迎珂[23]的方法來計(jì)算元素總釋放量.在浸泡第一天，各組Si的質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速增大，Ca的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本不變，在之后的浸泡過程中，Si的質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增大，Ca的質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)下降，而P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈一定程度的下降趨勢(shì).如圖8（c）所示，1.0 Si3N4-CPS與1.5 Si3N4-CPS兩組收集液中Si的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要低于其他兩組.參考磷灰石晶核成形-晶體生長(zhǎng)的理論[24-25]，Si3N4-CPS陶瓷浸泡SBF后，表面磷灰石沉積的過程是新相生成并不斷長(zhǎng)大的過程，在浸泡時(shí)，Si從CPS陶瓷中溶解釋放到周圍的溶液中.同時(shí)，在材料表面形成大量Si-OH，這些Si-OH為磷灰石提供了有利的成核位點(diǎn)，并進(jìn)一步吸收周圍環(huán)境中的鈣離子（Ca2+）、磷酸根離子（PO43-）和氫氧根離子（OH-）而形成磷灰石層.

2.3 Si3N4-CPS陶瓷體外細(xì)胞相容性

Si3N4-CPS陶瓷顆粒浸提液細(xì)胞增殖水平的CCK-8檢測(cè)結(jié)果如圖9所示.在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，各組之間細(xì)胞增殖的結(jié)果規(guī)律性不明顯.但可以發(fā)現(xiàn)：隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，每組細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量都逐漸增加，這表明所有的Si3N4-CPS陶瓷均具有良好的細(xì)胞相容性.

3 ?結(jié) 論

本工作采用生物相容性良好的α-Si3N4作為添加劑，以改善Ca5（PO4）2SiO4生物陶瓷的力學(xué)強(qiáng)度和生物活性.結(jié)果表明：α-Si3N4的添加能有效改善溶膠-凝膠法制備的CPS粉體的燒結(jié)性能.1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） Si3N4-CPS在1 300 ℃燒結(jié)后的最高彎曲強(qiáng)度是純CPS陶瓷的1.2倍左右.此外，SBF浸泡實(shí)驗(yàn)表明：α-Si3N4的加入能進(jìn)一步促進(jìn)CPS陶瓷表面磷灰石的形成，預(yù)示其具有良好的體外生物活性.細(xì)胞相容性結(jié)果也表明：Si3N4-CPS陶瓷具有良好的細(xì)胞相容性以及成為骨再生材料的潛力.

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（責(zé)任編輯：郁慧，包震宇）