張所兵，張?jiān)戚x，陳海元，林 靜，汪迎節(jié)，朱曉妹，宋春鳳，方先文

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014；2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院 植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014)

水稻栽培方式主要有移栽和直播2種栽培模式。移栽稻是將水稻種子先育苗，再栽插到大田中的一種栽培方式。直播稻是指將水稻種子直接播入大田中的一種栽培方式。較之移栽稻，直播稻省去了育秧和移栽2個(gè)環(huán)節(jié)，極大節(jié)約了種植成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。目前，許多國(guó)家水稻栽培模式主要以直播為主，如美國(guó)、澳大利亞、意大利、日本、斯里蘭卡和馬來(lái)西亞等[1-3]。隨著農(nóng)村青壯年勞動(dòng)力向非農(nóng)業(yè)領(lǐng)域轉(zhuǎn)移，我國(guó)直播稻面積也呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。直播稻的栽培面積在2007年以前的僅為2%，現(xiàn)在已增加至30%以上[4]。

制約直播稻發(fā)展的主要因素之一是直播時(shí)低溫、低氧的環(huán)境因素導(dǎo)致的出苗不齊、缺苗等現(xiàn)象[1, 5-10]。解決該問(wèn)題的有效措施是提高水稻種子耐低溫和低氧發(fā)芽能力。已有研究證實(shí)，水稻低氧發(fā)芽力在不同的水稻品種間存在明顯差異，且低氧發(fā)芽力是多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀[11-13]。侯名語(yǔ)等[11]利用Kinmaze/DV85 重組自交系群體分析了控制水稻低氧發(fā)芽力的QTL, 共檢測(cè)到5 個(gè)低氧發(fā)芽力QTL，分別位于第1，2，5，7 號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率10.5%～19.6%。Jiang等[14]利用USSR5/N22 F2群體定位了2個(gè)低氧發(fā)芽力QTLs，分別定位于第5，11號(hào)染色體，分別可以解釋15.51%和10.99%表型變異。陳孫祿等[12]利用R0380/RP2334回交自交系群體定位了4個(gè)低氧發(fā)芽力QTLs，分別定位于第2，3，8號(hào)染色體，貢獻(xiàn)率最小的為9.37%，貢獻(xiàn)率最大為17.34%。孫凱等[15]利用200 份水稻種質(zhì)為材料對(duì)低氧條件下，芽鞘長(zhǎng)度進(jìn)行GWAS分析，共檢測(cè)到15 個(gè)與芽鞘長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，分布在第3，4，5，6，8，11 染色體上。Yang等[16]利用YZX/02428重組自交系群體定位了25個(gè)低氧發(fā)芽力的QTL，分別位于除第11號(hào)染色體外的其他11條染色體上。

雖然人們?cè)谒镜脱醢l(fā)芽資源篩選及相關(guān)的QTL定位和基因克隆等方面取得了一定進(jìn)展，但總的來(lái)說(shuō)，控制低氧發(fā)芽遺傳位點(diǎn)的挖掘仍然比較有限。篩選新的耐淹水種質(zhì)資源，定位更多控制低氧發(fā)芽的QTL，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆，對(duì)水稻低氧萌發(fā)育種和闡明耐低氧發(fā)芽分子機(jī)理有重要意義。本研究以云南省秈稻地方品種扎西瑪和江蘇省優(yōu)良食味粳稻品種南粳46 構(gòu)建的RIL群體，對(duì)控制低氧發(fā)芽性狀進(jìn)行QTL定位，為下一步基因克隆和育種利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以云南省秈稻地方品種扎西瑪(母本)與江蘇省優(yōu)良食味粳稻品種南粳46(父本)為親本，用單粒傳法構(gòu)建了含有135個(gè)家系的RIL群體[15-17]。

2019年正季，親本材料及其包含135個(gè)家系的RIL群體種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京試驗(yàn)田。株距和行距分別為13.3，30.0 cm。田間管理與一般大田相同。

1.2 低氧發(fā)芽檢測(cè)

為了打破休眠，將親本及各家系的種子置于50 ℃烘箱中放置7 d。低氧發(fā)芽試驗(yàn)參照陳孫祿等[12]和Jiang等[14]進(jìn)行，具體如下：從親本及135個(gè)家系中，隨機(jī)選取健康飽滿一致的種子，用84消毒液(原液)消毒30 min，然后用無(wú)菌去離子水清洗5次后，置于裝滿無(wú)菌去離子水的10 cm高的離心管中，并密封。每份材料4管，每管5粒, 3次重復(fù)。于人工氣候室中28 ℃，黑暗培養(yǎng)。7 d后調(diào)查胚芽鞘長(zhǎng)度，作為低氧發(fā)芽力的指標(biāo)[12,16]。

1.3 QTL分析

用QTL IciMapping 4.0[18]檢測(cè)低氧發(fā)芽力QTL，LOD閾值設(shè)為2.5。QTL 命名按McCouch等[19]的方法進(jìn)行。

SSR標(biāo)記RM1300和RM1227選自Gramene(https://archive.gramene.org/)。RM1300引物序列為：RM1300-F:CAGCCATGAATGTTGGCTAC和RM1300-R:GCCATGTCCATTTATGGTGC，RM1227引物序列為：RM1227-F:CATGGTAGCACACACCCTTG和RM1227-R:CATCGACATGTGGACCACTC。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及群體低氧發(fā)芽分析

在低氧條件下發(fā)芽7 d后，以胚芽鞘長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)扎西瑪和南粳46低氧發(fā)芽力進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：扎西瑪胚芽鞘長(zhǎng)度為2.92 cm，而南粳46胚芽鞘長(zhǎng)度為6.68 cm，二者差異在P=0.01水平上達(dá)到極顯著水平(圖1)。扎西瑪/南粳46 RIL群體胚芽鞘長(zhǎng)度呈現(xiàn)為連續(xù)的分布，胚芽鞘長(zhǎng)度為1.32～5.99 cm，群體胚芽鞘長(zhǎng)度次數(shù)呈正態(tài)的分布(圖2)。

A.低氧條件下發(fā)芽7 d，扎西瑪(左)和南粳46表型(右)；B.低氧條件下發(fā)芽7 d，扎西瑪和南粳46胚芽鞘長(zhǎng)度；A′和B′表示P=0.01水平差異顯著。

圖2 扎西瑪/南粳46 RIL群體胚芽鞘長(zhǎng)度次數(shù)分布

2.2 低氧發(fā)芽QTL分析

本研究前期構(gòu)建了扎西瑪/南粳46 RIL群體SSR標(biāo)記分子連鎖圖譜，該圖譜共包含202對(duì)SSR標(biāo)記，總長(zhǎng)度為1 437.3 cM，平均圖距為8.1 cM，能滿足QTL 作圖的要求。根據(jù)群體中135個(gè)家系低氧發(fā)芽力數(shù)據(jù)，利用QTL Ici-Mapping 4.0對(duì)控制低氧發(fā)芽QTL進(jìn)行檢測(cè)，在第12號(hào)染色體上的RM1300和RM1227之間檢測(cè)到一個(gè)控制低氧發(fā)芽力的QTL(qAG-12)，qAG-12位于第12染色體上26.00～27.34 Mb的1.34 Mb范圍內(nèi)。該QTL來(lái)自南粳46，LOD值為3.04，可以解釋11.24%的表型變異(圖3)。

圖3 水稻低氧發(fā)芽力QTL檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

耐淹成苗率低、雜草問(wèn)題等是影響直播稻產(chǎn)量的重要因素。與傳統(tǒng)的移栽稻相比，直播稻種子在萌發(fā)時(shí)處于淹水環(huán)境之中。淹水環(huán)境有利于控制田間雜草卻不利于直播稻成苗，水直播稻成苗率通常在30%左右[20]。這主要?dú)w因于以往的育種過(guò)程中，很少對(duì)低氧萌發(fā)等與直播水稻相關(guān)的性狀進(jìn)行人為選擇，這直接導(dǎo)致目前市場(chǎng)上正在推廣的絕大多數(shù)水稻品種不適合進(jìn)行田間直播[20-22]。開(kāi)展耐淹水的種質(zhì)資源篩選，挖掘在低氧條件下萌發(fā)能力強(qiáng)的水稻資源，并在水稻育種過(guò)程中加以利用和選擇是提高耐淹成苗率的關(guān)鍵。此外，控制耐淹成苗率的遺傳位點(diǎn)的挖掘仍然比較有限，且控制耐淹成苗率的遺傳位點(diǎn)都是由多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，遺傳力較低，常規(guī)的育種選擇費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，開(kāi)展控制耐淹成苗率的遺傳位點(diǎn)的定位研究，繼而進(jìn)行多基因分子標(biāo)記輔助聚合育種，有望提高水稻種子低氧發(fā)芽能力，進(jìn)而改善解決直播稻全苗問(wèn)題。

本研究對(duì)云南地方品種扎西瑪和江蘇省優(yōu)質(zhì)稻品種南粳46低氧發(fā)芽進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)二者差異極顯著，進(jìn)而利用扎西瑪/南粳46 RIL群體在12染色體上定位到一個(gè)主效QTL，位于SSR標(biāo)記RM1300和RM1227之間，為該QTL育種利用提供了材料和分子標(biāo)記。將RM1300和RM1227在日本晴基因組中進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)其位于第12染色體上26.00～27.34 Mb。該候選區(qū)域未見(jiàn)報(bào)道的低氧發(fā)芽的QTL，故qAG-12是一個(gè)新的QTL。在Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)對(duì)該候選區(qū)間注釋發(fā)現(xiàn)，在這1.34 Mb范圍內(nèi)共有200多個(gè)注釋基因。接下來(lái)，擬從扎西瑪/南粳46 RIL群體中選擇含有qAG-12單株與扎西瑪構(gòu)建F2次級(jí)分離群體，對(duì)qAG-12進(jìn)行精細(xì)定位，為下一步基因克隆奠定基礎(chǔ)。

在淹水條件下，扎西瑪和南粳46種子低氧發(fā)芽力呈現(xiàn)極顯著差異，并利用扎西瑪/南粳46 RIL群體在第12染色體上定位到一個(gè)新的控制水稻種子低氧發(fā)芽力的QTL(qAG-12)。