代小冬,朱燦燦,王春義,秦 娜,宋迎輝,代書桃,李君霞

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所,河南 鄭州 450002)

干旱脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)、光合作用、氣孔運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)代謝等產(chǎn)生不良影響,進(jìn)一步影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)顯著下降。全球干旱、半干旱地區(qū)約占土地總面積的36%,占耕地面積的43%。中國(guó)是世界上主要干旱國(guó)家之一,干旱與半干旱土地面積約占全國(guó)土地面積的52.5%,占全國(guó)耕地面積的38%[1]。我國(guó)每年因干旱造成的糧食減產(chǎn)占?xì)庀鬄?zāi)害損失的50%左右。谷子(Setariaitalica(L.)Beauv)古稱粟,起源于我國(guó)黃河流域,是禾本科狗尾草屬的一個(gè)栽培種(2n=2X=18),是世界上最古老的栽培作物,迄今已經(jīng)有8 700多年的歷史[2]。我國(guó)谷子的種植面積約200萬(wàn)hm2,約占世界谷子總面積的80%,產(chǎn)量占世界總產(chǎn)的90%[3]。谷子以其抗旱耐瘠、營(yíng)養(yǎng)豐富、耐儲(chǔ)藏著稱。另外,谷子還是優(yōu)良的飼草作物,是旱區(qū)畜牧業(yè)重要的飼料來源[4]。谷子的抗旱優(yōu)勢(shì)已被人們熟知和接受,對(duì)谷子抗旱性的研究也越來越受到人們的重視。代小冬等[5]認(rèn)為,在PEG滲透劑模擬干旱脅迫下,谷子活力抗旱指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)胚芽長(zhǎng)、相對(duì)胚根長(zhǎng)與萌發(fā)抗旱指數(shù)極顯著正相關(guān),可以作為谷子萌芽期抗旱性鑒定的指標(biāo)。高汝勇等[6]研究了12個(gè)谷子品種的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長(zhǎng)、苗高、鮮質(zhì)量、活力指數(shù),并采用模糊隸屬函數(shù)對(duì)其抗旱性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Qie等[7]利用谷子品種豫谷1號(hào)與青狗尾草構(gòu)建的RIL群體定位到18個(gè)與抗旱相關(guān)的QTL。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn),SiARDP參與了依賴于ABA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在提高谷子抗旱方面發(fā)揮了重要作用。Feng等[9]通過對(duì)谷子中39個(gè)核因子Y(NF-Y)基因的功能分析發(fā)現(xiàn),SiNF-YA1和SiNF-YB8可以激活相關(guān)抗旱基因,提升谷子生理狀態(tài),達(dá)到抗旱的目的。Tang等[10]對(duì)抗旱品種豫谷1號(hào)和干旱敏感品種安-04在干旱條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,并結(jié)合耐旱相關(guān)的QTL,確定了20個(gè)抗旱候選基因。Wang等[11]發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫條件下有14個(gè)miRNAs 的表達(dá)量上調(diào),4個(gè)miRNAs的表達(dá)量下調(diào)。Pan等[12]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的方法發(fā)現(xiàn)了321個(gè)蛋白與谷子的抗旱性相關(guān)。谷子的抗旱性研究雖然取得了一定的進(jìn)展,但是由于谷子是區(qū)域性的小雜糧作物,對(duì)其研究的廣度和深度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。鑒于此,本研究利用山西2010和K359×M4-1構(gòu)建的F2群體為作圖群體,采用 2b-RAD測(cè)序技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜,并進(jìn)行谷子萌芽期抗旱相關(guān)QTL定位,以期鑒定一些新的、可穩(wěn)定遺傳的QTL位點(diǎn),為解析谷子抗旱機(jī)制及抗旱新品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料山西2010和K359×M4-1分別來源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所和河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所。山西2010不僅具有較強(qiáng)的萌芽期抗旱性,而且在谷子苗期抗旱性鑒定評(píng)價(jià)中表現(xiàn)良好。K359×M4-1雖然具有兼抗咪唑乙煙酸和拿捕凈2種除草劑的優(yōu)異性狀,但是其萌芽期抗旱性較弱。以山西2010為母本,K359×M4-1為父本配制雜交組合,獲得包含100個(gè)單株的F2群體,并利用F2∶3家系的抗旱性確定F2群體的表型。

1.2 谷子萌芽期干旱脅迫處理

利用20%的PEG 6000對(duì)親本及100個(gè)F2∶3家系種子進(jìn)行萌芽期抗旱性鑒定。每份材料選擇飽滿的種子,首先用5%次氯酸鈉消毒15 min,然后用ddH2O沖洗干凈。選擇50粒滅過菌的種子放入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中,然后將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱,28 ℃暗培養(yǎng)。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5 mL 20%的PEG 6000,作為干旱脅迫處理;加入5 mL ddH2O,作為對(duì)照,重復(fù)3次。

1.3 萌芽期抗旱性調(diào)查

分別調(diào)查第2,4,6,8天種子的發(fā)芽數(shù),并將第2,4,6,8天的種子萌發(fā)率記為nd2、nd4、nd6、nd8。參考Bouslama等[13]的方法計(jì)算萌發(fā)指數(shù)(PI,Promptness index)和萌發(fā)抗旱指數(shù)(SIDR,Sprout index of drought resisting),PI=1.00nd2+0.75nd4+0.50nd6+0.25nd8,SIDR=處理萌發(fā)指數(shù)/對(duì)照萌發(fā)指數(shù)。

1.4 建庫(kù)測(cè)序與基因分型

提取萌發(fā)種子的基因組DNA,抽提合格后,利用2b-RAD五標(biāo)簽串聯(lián)技術(shù)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建,文庫(kù)質(zhì)控合格后在Illumina Hiseq X10平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序(青島歐易生物科技有限公司)。利用SOAP軟件[14]將各樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考序列上,獲得可用于分型的Unique標(biāo)簽數(shù)目及深度。利用最大似然法進(jìn)行SNP位點(diǎn)的分型。為保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性,分型工作完成后對(duì)分型結(jié)果進(jìn)一步過濾:①剔除所有樣品中低于80%個(gè)體可以分型的位點(diǎn);②剔除MAF低于0.01的位點(diǎn);③剔除含有1種或4種堿基型的SNP位點(diǎn);④剔除標(biāo)簽內(nèi)多于2個(gè)SNP的位點(diǎn);⑤剔除只有1種分型的位點(diǎn)。然后篩選親本純合的SNP差異位點(diǎn),并進(jìn)行子代分型轉(zhuǎn)化。

1.5 遺傳圖譜構(gòu)建

使用Joinmap 4.1[15]軟件剔除相似度=1的冗余標(biāo)記,剔除X2>100的標(biāo)記,剔除可分型個(gè)體數(shù)<80%的標(biāo)記。將符合條件的標(biāo)記利用Joinmap 4.1 軟件進(jìn)行連鎖圖譜的構(gòu)建,標(biāo)記以LD>5進(jìn)行分群,使用回歸算法和Kosambi′s函數(shù)[16]計(jì)算遺傳距離。

1.6 基因定位

根據(jù)作圖群體表型數(shù)據(jù),結(jié)合遺傳連鎖圖譜,對(duì)性狀利用MapQTL[17]軟件進(jìn)行QTL分析。具體分析步驟如下:①利用置換檢驗(yàn)做1 000次重復(fù),估算單個(gè)連鎖群范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD閾值;②利用區(qū)間作圖法(Interval mapping,IM)進(jìn)行QTL分析,在每條連鎖群上每隔1 cM對(duì)QTL存在的可能性掃描一次;③以單個(gè)連鎖群范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD值作為閾值,即出現(xiàn)一個(gè)LOD峰值大于或等于閾值時(shí)視為該位點(diǎn)存在一個(gè)QTL。LOD峰值位置即為相應(yīng)QTL基因最可能的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本與100個(gè)F2∶3家系的萌芽期抗旱性分析

山西2010的萌芽期抗旱性較好,萌發(fā)抗旱指數(shù)達(dá)到0.92,K359×M4-1的萌芽期抗旱性較差,僅為0.64。F2群體的萌發(fā)抗旱指數(shù)在0.47～0.94。表現(xiàn)出連續(xù)偏正態(tài)分布(圖1),表明該性狀為多基因控制的數(shù)量性狀。

圖1 親本及F2群體萌芽期抗旱性分析

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建結(jié)果

以山西2010與K359×M4-1雜交得到F2群體為作圖群體,利用篩選到的583個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建,獲得一張包含9個(gè)連鎖群的圖譜,總長(zhǎng)為566.8 cM,標(biāo)記平均間隔為0.97 cM(表1)。每條染色體長(zhǎng)度為31.4～94.3 cM,平均長(zhǎng)度為63.0 cM。染色體標(biāo)記數(shù)目為31～106個(gè),平均數(shù)目為64.8個(gè)。

表1 構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜信息

2.3 萌芽期抗旱性分析

利用MapQTL軟件對(duì)萌芽期抗旱性進(jìn)行QTL分析,共檢測(cè)到3個(gè)萌芽期抗旱性相關(guān)QTL位點(diǎn),分別位于第5,6染色體上,分別命名為qSIDR-5a、qSIDR-6a和qSIDR-6b(表2、圖2),可解釋12.4%～14.3%的表型變異,其中,第5染色體上qSIDR-5a的表型貢獻(xiàn)率最高,達(dá)到14.3%。

圖2 谷子萌芽期抗旱性QTL檢測(cè)

表2 F2群體中檢測(cè)到的萌芽期抗旱性QTL

3 結(jié)論與討論

干旱是限制作物生長(zhǎng)的主要非生物逆境之一,對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的影響。谷子起源于我國(guó),并在長(zhǎng)期的馴化和栽培過程中適應(yīng)了干旱、半干旱地區(qū)的生態(tài)環(huán)境,成為一種優(yōu)良的抗旱資源,在作物抗旱種質(zhì)利用方面具有獨(dú)特的研究?jī)r(jià)值[18]。另外,谷子具有基因組小、重復(fù)序列少、生育期短、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn),已漸漸成為功能基因組研究的新模式作物。所以,谷子在抗旱機(jī)制研究方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

萌芽期是作物對(duì)水分最敏感的時(shí)期,如果該時(shí)期受到干旱,將會(huì)對(duì)作物的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量水平造成極大的影響[19]。萌芽期抗旱性研究在對(duì)谷子抗旱性早期鑒定和適宜干旱半干旱地區(qū)谷子品種選擇方面具有重要的意義。萌發(fā)抗旱指數(shù)是評(píng)價(jià)種子萌芽期抗旱性的可靠指標(biāo)[13]。利用這個(gè)指標(biāo),已經(jīng)成功鑒定出谷子[5,20]、水稻[21]、玉米[22]等作物的萌芽期抗旱性。

近年來,分子標(biāo)記技術(shù)在作物抗逆性研究和優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗品種選育方面發(fā)揮了重要作用[23-27]。過去常用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的第2代分子標(biāo)記主要是 RFLP、AFLP、RFLP、ISSR和SSR等,隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,SNP因具有良好的多態(tài)性和極高的豐度成為植物遺傳育種研究中的理想遺傳標(biāo)記[28]。眾多學(xué)者利用SNP標(biāo)記構(gòu)建了多種作物的連鎖圖譜,并成功對(duì)控制小麥抽穗期和開花期[29]、玉米葉色[30]、鋁脅迫下甘藍(lán)型油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀[31]、甜瓜果實(shí)苦味[32]等的基因進(jìn)行了定位。利用SNP遺傳圖譜研究谷子萌芽期抗旱性還屬首次。本研究利用SNP遺傳圖譜,對(duì)干旱脅迫條件下親本及作圖群體種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)進(jìn)行了QTL定位分析。共檢測(cè)到3個(gè)控制谷子萌芽期抗旱性的QTL,分別位于第5和第6染色體上。其中第5染色體上qSIDR-5a的表型貢獻(xiàn)率最高,達(dá)到14.3%。通過與Qie等[7]研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),本研究定位的3個(gè)萌芽期抗旱QTL均未找到相同區(qū)間報(bào)道,是新的QTL。

谷子抗旱機(jī)制復(fù)雜,關(guān)于抗旱分子機(jī)制的研究還處于起步階段。隨著谷子基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究的不斷深入,越來越多的谷子抗旱相關(guān)基因?qū)?huì)不斷被挖掘,本研究結(jié)果可為闡明谷子抗旱分子機(jī)制和指導(dǎo)谷子生產(chǎn)實(shí)際奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。