張安紅,趙戰(zhàn)勝,王志安,肖娟麗,劉 圓,羅曉麗

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)棉花研究所,山西 運(yùn)城 044000;2.棉花種質(zhì)資源利用與分子設(shè)計(jì)育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 運(yùn)城 044000;3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆 五家渠 831300)

類黃酮(Flavonoids)是一類多酚類次生代謝產(chǎn)物,其不但參與植物的花、果實(shí)和種子顏色的形成,而且在抵御逆境脅迫、抗氧化、抗衰老等方面發(fā)揮著較大的作用[1]。植物類黃酮生物合成主要受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因兩類基因的控制。目前,調(diào)控類黃酮生物合成的調(diào)節(jié)基因已在葡萄、擬南芥、玉米、金魚草、矮牽牛、蘋果等多種植物中被克隆得到,而且這些調(diào)節(jié)基因大多屬于編碼MYB、MYC、bZIP、WD40和鋅指蛋白等的基因家族[1-4],其中,MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最大、功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子之一,也是花青苷(一種黃酮類化合物)合成途徑中重要的調(diào)控因子,主要調(diào)控花青素上游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),在植物生命活動(dòng)中扮演著重要的角色[5-6]。MYB蛋白根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)分為R1-MYB、R2R3-MYB和R3-MYB共3類[7-8],其中,R2R3-MYB主要參與調(diào)控花青苷合成途徑[9]。近年來,棉花MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究已在非生物脅迫的功能研究方面取得較大進(jìn)展,但是關(guān)于GhMYBPA轉(zhuǎn)錄因子研究還相對(duì)較少。高巍等[10]對(duì)海島棉轉(zhuǎn)錄因子基因GbMYB60研究發(fā)現(xiàn),該基因受甘露醇、NaCl、低溫、高溫等非生物逆境以及脫落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水楊酸等植物激素的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。丁震乾等[11]研究發(fā)現(xiàn),抑制GhRAX3基因表達(dá)致使棉花葉片相對(duì)含水量和總抗氧化物酶活性顯著降低,葉片離子滲漏率和丙二醛含量顯著升高,使棉花耐干旱脅迫能力下降。李菲等[12]克隆了棉花GhMYB11基因,該基因在黃萎病菌侵染以及在干旱、鹽和氧化脅迫處理后的棉花幼苗葉片中表達(dá)顯著上調(diào),推測GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物脅迫反應(yīng)中起重要調(diào)控作用,是陸地棉品種抗逆性遺傳改良的重要候選基因。胡雪虹等[13]研究發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的MYB類轉(zhuǎn)錄因子,克隆并命名該基因?yàn)镚bMYB5,對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明,其在棉花的莖、葉、蕾、絮和未成熟的種子中均有表達(dá),尤以葉片中的表達(dá)量最高,說明MYB類轉(zhuǎn)錄因子具有較強(qiáng)的抗逆功能。MYBPA是調(diào)控黃酮類次生代謝物質(zhì)原花青素合成途徑的主要MYB轉(zhuǎn)錄因子之一,在器官形態(tài)建成、激素和逆境因子應(yīng)答等過程中起重要的作用[14-15]。

本研究從陸地棉品種中棉35中克隆到1個(gè)新的MYB基因,命名為GhMYBPA1(基因登錄位點(diǎn)為XM_016869420),利用生物信息學(xué)分析了其核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了該基因在不同組織及逆境脅迫下的表達(dá)模式,旨在為進(jìn)一步研究該基因在抗逆過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為陸地棉品種中棉35,由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所生物技術(shù)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料培養(yǎng)與處理 棉花種子經(jīng)硫酸脫絨后播種于裝滿蛭石的營養(yǎng)缽中,在(26±2)℃的溫室中進(jìn)行萌發(fā)和生長;待棉花幼苗長出2片真葉時(shí),分別隨機(jī)采取部分棉花的根、莖、葉以及棉花生長發(fā)育的花期分別采集花,用于不同組織基因的表達(dá)分析。另外,選取長出3片真葉生長一致的棉花,分別對(duì)幼苗進(jìn)行NaCl(200 mmol/L)處理、低溫(4 ℃)處理和20%的PEG 6000處理,于0(CK),1,3,6,12 h分別收集鹽、低溫、干旱脅迫處理的幼苗,用于檢測基因的非生物脅迫響應(yīng)。材料取樣后進(jìn)行液氮速凍,置于-80 ℃冰箱保存,備用。

1.2.2 總RNA提取和cDNA制備 參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行,利用TRIzol試劑提取棉花不同脅迫處理時(shí)間的幼苗總RNA。單鏈cDNA合成參照SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System試劑盒操作說明書進(jìn)行,用于基因克隆和定量PCR分析。

1.2.3 棉花GhMYBPA1基因克隆 根據(jù)GenBank中已公布的棉花GhMYBPA1(2016年公布的GhMYBPA1XM_016869420)基因序列信息合成引物GhMYBPA1-F(5′-ATGGCAGAGCACCTTGTTG-3′)和GhMYBPA1-R(5′-TTAAATGAGTAGTGATTCGGCG-3′),以提取的棉花cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并進(jìn)行凝膠回收、純化,后與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆篩選及菌落PCR的鑒定,將陽性菌落送交上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

1.2.4 棉花GhMYBPA1基因的生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和保守性分析;采用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;通過在線分析軟件ProtParam tool(http://expasy.org/protparam/)分析目的蛋白的理化性質(zhì)。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析 設(shè)計(jì)GhMYBPA1基因引物F(5′-AGATCAACTGGTTATGCTT GCT-3′)和R(5′-AACACAAATGTACATCGCACAC-3′)。以棉花基因Ubiquitin(登錄號(hào)為AY189972)作為內(nèi)參基因,擴(kuò)增引物為F(5′-AAGACCTACACCAAGCC CAAG-3′)和R(5′-ACACTCCGCATTAGGACACTC-3′)。以棉花根、莖、葉和花及各個(gè)脅迫處理時(shí)間點(diǎn)的樣品cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析GhMYBPA1基因的組織表達(dá)模式及不同非生物脅迫下的表達(dá)模式。qRT-PCR所用的反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性10 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,并采用2-ΔΔCt計(jì)算方法求得棉花根、莖、葉、花和不同逆境脅迫處理下樣品的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMYBPA1基因全長cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank中已公布(基因登錄位點(diǎn)為XM_016869420)的棉花GhMYBPA1基因序列信息合成引物,從提取的棉花cDNA中克隆得到GhMYBPA1基因的全長序列,GhMYBPA1全長cDNA為825 bp(圖1),其中,編碼序列CDS 630 bp,編碼210個(gè)氨基酸,3′和5′端非編碼區(qū)分別為150,160 bp。預(yù)測分子質(zhì)量約為20.183 ku,等電點(diǎn)為6.42。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),GhMYBPA1序列中包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別位于第13-63位和第66-114位氨基酸,屬于R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖2)。

圖1 棉花GhMYBPA1基因擴(kuò)增片段大小

實(shí)線框和虛線框分別代表2個(gè)SANT保守結(jié)構(gòu)域。

同源性分析結(jié)果表明,GhMYBPA1蛋白與亞洲棉(GaMYB12-like XM_017769421)、雷蒙德氏棉(GrMYB308-like XM_012619612)、陸地棉(GhMYB308-like XM_016825942)、可可(TheobromacacaoMYB308 XM_007051442)、月季(RosachinensisMYB8-like XM_024317461)、棗(ZiziphusjujubaMYB308-like XM_016033215)、胡桃(JuglansregiaMYBHv1-like XM_018991195)、蓖麻(RicinuscommunisMYB30-like XM_002518832)的氨基酸序列相似度分別為99%,96%,96%,76%,60%,53%,54%,49%(圖3)。

圖3 GhMYBPA1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 GhMYBPA1基因在不同組織中的表達(dá)分析

以棉花不同組織的cDNA為模板,對(duì)GhMYBPA1基因在棉花的根、莖、葉、花等組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明(圖4),GhMYBPA1基因在棉花的根、莖、葉、花組織中均有表達(dá),其表達(dá)量表現(xiàn)為花>葉>根>莖,組織間差異均顯著，其中,在花和葉片中的表達(dá)量較高,而在根和莖中的表達(dá)量相對(duì)較低。說明GhMYBPA1基因功能可能涉及多個(gè)方面。

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。圖5-7同。

2.3 逆境脅迫下GhMYBPA1基因表達(dá)分析

在各種非生物逆境脅迫下對(duì)GhMYBPA1基因進(jìn)行分析,結(jié)果表明,棉花植株在200 mmol/L NaCl脅迫下,GhMYBPA1基因表達(dá)量顯著升高,在3 h時(shí),基因表達(dá)量達(dá)到最高,之后表達(dá)量顯著降低(圖5);在4 ℃低溫脅迫1 h時(shí),GhMYBPA1基因表達(dá)量達(dá)到最高,為未處理對(duì)照表達(dá)量的4.8倍,在低溫脅迫3,6,12 h時(shí),GhMYPBA1基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(圖6);植株在PEG模擬干旱脅迫下,在處理1 h后GhMYBPA1基因相對(duì)表達(dá)量開始顯著增加,且隨著處理時(shí)間的增加而增加(圖7)。結(jié)果表明,GhMYBPA1基因的表達(dá)受到高鹽、低溫和干旱脅迫時(shí)均有響應(yīng),由此推測,GhMYBPA1基因在棉花響應(yīng)高鹽、低溫和干旱等非生物脅迫中起著一定的作用。

圖5 鹽脅迫后GhMYBPA1基因的相對(duì)表達(dá)量

圖6 低溫脅迫后GhMYBPA1基因的相對(duì)表達(dá)量

圖7 干旱脅迫后GhMYBPA1基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最大、功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子之一,其調(diào)控過程受多種激素及環(huán)境誘導(dǎo),在植株的生長發(fā)育過程、逆境脅迫、次生代謝中起著重要作用,是改良植物遺傳特性的良好基因資源。目前,大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能尚待進(jìn)一步研究。在類黃酮代謝途徑中,MYB轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合與某些關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子中的重要順式作用元件,調(diào)控類黃酮生物合成途徑中基因的表達(dá),有效地調(diào)節(jié)類黃酮生物合成途徑[17]。呂東等[18]克隆了紅肉蘋果MpMYBPA1基因,并對(duì)該基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在紅肉蘋果中低溫有利于MpMYBPA1基因的表達(dá),并且該基因受ABA調(diào)控。白蓓蓓等[19]克隆了芒果MinMYBPA基因,初步確定該基因與芒果果實(shí)花青素合成相關(guān)。雒珺瑜等[20]研究得出,蕾期棉花葉片中花青素含量與綠盲蝽抗性呈顯著正相關(guān),表明植物中的次生代謝物質(zhì)具有抵御害蟲危害的作用,棉花葉片原花青素提取物能夠抑制棉花主要害蟲的生長。目前,棉花中有關(guān)GhMYBPA調(diào)控的原花青素的研究與原花青素合成相關(guān)的功能基因還未見報(bào)道。

本研究從陸地棉中克隆得到1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因GhMYBPA1(基因登錄位點(diǎn)為XM_016869420),GhMYBPA1全長cDNA為825 bp,其中,編碼序列開放閱讀框630 bp,編碼210個(gè)氨基酸,3′和5′端非編碼區(qū)分別為150,160 bp。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),GhMYBPA1序列中包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,屬于R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子,系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),GhMYBPA1與亞洲棉GaMYB12-like最為相近。

本研究克隆了GhMYBPA1基因,并在不同組織器官的表達(dá)及其在低溫、干旱、鹽等非生物逆境脅迫下對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)分析,該基因在棉花根、莖、葉、花中均有表達(dá),在花中相對(duì)表達(dá)量最高,其次是葉,并且受到高鹽、低溫和干旱處理誘導(dǎo),可以推測其在低溫、干旱、鹽等非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,為后續(xù)基因功能的研究提供了理論支撐。