董 輝,楊 莉,李 莉,張建軍,范婧芳,宋世佳,楊 雷,李海山

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 石家莊果樹研究所,河北 石家莊 050061;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院,河北 石家莊 050031;3.河北省植保植檢總站,河北 石家莊 050035)

栽培草莓(Fragaria×ananassa, 2n=8X=56)是薔薇科草莓屬的多年生草本植物,是重要的經(jīng)濟(jì)作物,在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。中國是世界草莓第一生產(chǎn)國,種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[1]。栽培草莓起源于智利草莓(Fragariachiloensis)和弗州草莓(Fragariavirginiana)的偶然雜交[2],為異源八倍體,相較于二倍體作物其遺傳背景復(fù)雜,相關(guān)的遺傳育種研究具有一定難度。近年來,AFLP、SCAR、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于栽培草莓遺傳圖譜的構(gòu)建和數(shù)量性狀的QTL定位、遺傳進(jìn)化分析及親緣關(guān)系鑒定[3-5],Weebadde等[6]構(gòu)建了429個標(biāo)記定位的總圖距1 541 cM的AFLP圖譜,van Dijk等[7]構(gòu)建了508個標(biāo)記定位的總圖距1 846 cM的SSR圖譜,此外還包括多個標(biāo)記相結(jié)合繪制的整合圖譜[8],但是由于標(biāo)記本身的特性和數(shù)量限制,構(gòu)建的圖譜密度和飽和度較低。

隨著新一代測序技術(shù)(NGS)的發(fā)展以及SNP標(biāo)記的開發(fā)利用,使得利用SNP標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜成為可能,圖譜從質(zhì)量和清晰度上都有了很大的提高。近年來,這項(xiàng)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于栽培草莓中。2015年,Bassil等[9]在栽培草莓中獲得了6 594個標(biāo)記定位的總圖距2 050 cM的SNP圖譜。2017年,Nagano等[10]在栽培草莓中獲得了11 574個標(biāo)記定位的總圖距2 816.5 cM的SNP和SSR的整合圖譜。

本研究利用石家莊果樹研究所自育高抗白粉病草莓品種紅星為母本,日本高感白粉病草莓品種紅顏為父本構(gòu)建F1群體,通過SLAF-seq技術(shù)對栽培草莓F1群體進(jìn)行高通量測序和SNP標(biāo)記的開發(fā),構(gòu)建了高密度SNP遺傳圖譜,并對其特征和應(yīng)用進(jìn)行了分析研究。該圖譜的構(gòu)建有助于后期開發(fā)分子實(shí)用性標(biāo)記,為栽培草莓的數(shù)量性狀基因定位和基因克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年以石家莊果樹研究所自育高抗白粉病草莓品種紅星為母本,日本高感白粉病草莓品種紅顏為父本雜交,2016年2月播種雜交種子,2016年9月將實(shí)生苗移栽進(jìn)溫室大棚內(nèi),進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

采集紅星×紅顏雜種分離群體F1中200株子代及雙親的幼嫩草莓葉片,采用CTAB法提取基因組DNA,檢測合格后,運(yùn)用SLAF-seq技術(shù)和HighMap軟件開發(fā)高密度分子標(biāo)記,構(gòu)建遺傳圖譜。

1.2.1 酶切方案設(shè)計(jì)及測序 根據(jù)草莓基因組大小、GC含量等信息,進(jìn)行酶切預(yù)測,最終選擇最適內(nèi)切酶Hpy166II,定義SLAF標(biāo)簽酶切片段長度為314～394 bp,預(yù)計(jì)可得到126 427個SLAF標(biāo)簽。目的片段的篩選采用最適酶切方案進(jìn)行酶切試驗(yàn),SLAF標(biāo)簽加A處理、連接Dual-index[11]測序接頭等,文庫質(zhì)檢合格后用Illumina Xten進(jìn)行PE150 bp測序,同時選用日本晴水稻(OryzasativaL.japonica)作為對照,用來評估建庫試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.2.2 SNP開發(fā)及編碼 為了確保SNP的準(zhǔn)確性,根據(jù)測序數(shù)據(jù)在栽培草莓參考基因組(ftp://ftp.kazusa.or.jp/pub/strawberry/genome/)上的定位結(jié)果,綜合GATK和Samtools 2種方法得到的交集變異位點(diǎn)。為了便于遺傳分析采用遺傳學(xué)通用的等位編碼規(guī)則,對多態(tài)性標(biāo)簽進(jìn)行基因型編碼。

1.2.3 圖譜構(gòu)建 將多態(tài)性SNP標(biāo)記按照相應(yīng)步驟進(jìn)行過濾,用以保證遺傳圖譜質(zhì)量:首先,去掉親本測序深度小于4X的標(biāo)記,選擇基因型覆蓋所有子代60%以上個體的標(biāo)記;其次,參考Huang等[12]方法將篩選出的SNP標(biāo)記分為28個連鎖群,計(jì)算兩兩標(biāo)記之間的MLOD值[13],去掉與其他SNP的MLOD值低于25的標(biāo)記;最后,采用HighMap[14]軟件以連鎖群為單位分析估算標(biāo)記的線性排列及相鄰標(biāo)記間的遺傳距離,最后,參考Sun等[15]方法對遺傳圖譜質(zhì)量進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLAF文庫建立及高通量測序

2.1.1 SLAF文庫建立 使用Hpy166II內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切。SLAF標(biāo)簽長度為314～394 bp。預(yù)測得到126 427個在基因組上分布均勻的SLAF標(biāo)簽。以水稻測序數(shù)據(jù)為對照,用來評估酶切方案實(shí)施的有效性和酶切效率,本次試驗(yàn)中,對照酶切效率為95.22%,雙端比對效率為93.41%,說明SLAF建庫正常。根據(jù)標(biāo)簽的實(shí)際長度繪制對照序列插入片段的長度分布圖,發(fā)現(xiàn)大部分對照序列的插入片段長度在預(yù)期的范圍之內(nèi),建庫質(zhì)量良好(圖1)。

圖1 對照序列插入片段分布圖

2.1.2 測序質(zhì)量值驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)測序質(zhì)量,對測序質(zhì)量值Q30進(jìn)行了散點(diǎn)圖圖示驗(yàn)證。通過母本測序質(zhì)量值作圖(圖2),發(fā)現(xiàn)在Q30>40的質(zhì)量值范圍內(nèi)分布著絕大部分堿基,說明測序精確度高。

橫坐標(biāo)為堿基位置,縱坐標(biāo)為質(zhì)量值。前后100 bp分別為第一端和另外一端測序數(shù)據(jù)的Q30分布。同一個位置對應(yīng)的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量越高,顏色越深。

2.1.3 堿基分布檢查 通過檢測有無AT、GC分離現(xiàn)象,對母本測序堿基分布情況進(jìn)行評估(圖3)。從分布圖可以看出,A與T、G與C分布一致,符合堿基配對原則,說明得到了有效的SLAF序列,可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

橫、縱坐標(biāo)分別為堿基位置和比率;堿基A、C、G、T和識別不出的N分別用綠色、紅色、橙色、藍(lán)色和灰色表示。前后100 bp分別為第一端和另一端測序數(shù)據(jù)的堿基分布。

2.1.4 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評估 通過SLAF文庫的建立和高通量測序,共獲得565 919 066 reads,(表1),測序量值Q30為95.36%,GC含量為39.68%,分布正常;其中父母本分別獲得16 140 629,12 601 802 reads,Q30分別為96.28%和96.41%,GC含量分別為40.24%和39.25%;子代獲得2 685 883 reads,平均Q30為95.35%,平均GC含量為39.68%。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 標(biāo)記開發(fā)

本研究共獲得2 136 939個SNP標(biāo)簽,能成功分型的數(shù)目為152 515個,過濾掉aaxbb后得到可用于作圖的SNP標(biāo)記56 237個;同時還開發(fā)了717 881個SLAF標(biāo)簽。

2.3 遺傳圖譜構(gòu)建及評估

2.3.1 遺傳圖譜構(gòu)建 過濾掉與其他SNP標(biāo)簽的MLOD值均低于25的標(biāo)簽,共上圖14 412個SNP,構(gòu)建了28個連鎖群,遺傳圖譜的總圖距為4 022.16 cM,標(biāo)記完整度為99.84%(上圖標(biāo)記中,確定基因型的標(biāo)記占總標(biāo)記的比例),標(biāo)記間平均距離為0.28 cM(表2、圖4)。

表2 栽培草莓遺傳圖譜基本信息統(tǒng)計(jì)

圖4 栽培草莓遺傳圖譜

最大縫隙越小表示圖譜越均勻,遺傳圖譜上最大和最小縫隙分別為17.49,4.77 cM,分別位于LG8和LG9,說明SNP的分布不是完全均勻的。由475個標(biāo)記組成,長度為199.36 cM的LG1為28個連鎖群中最大的,最小的連鎖群為LG23,由284個標(biāo)記組成,長度為74.67 cM。

2.3.2 遺傳圖譜評估

2.3.2.1 單體來源評估 連鎖群LG1單體來源主要都是藍(lán)色和綠色,說明本研究每個個體中較大區(qū)段均來源于親本,而無法判斷的白色區(qū)域和代表缺失的灰色區(qū)域占的比例很小,圖譜質(zhì)量高(圖5)。

每個標(biāo)記用一個橫行表示,樣品中的每條染色體用一個豎列表示,每個個體的父、母本染色體分別用第一、二列表示,個體之間用空白列隔開,來自親本第一個、第二個、無法判斷和缺失的等位基因分別用綠色、藍(lán)色、白色和灰色表示。

2.3.2.2 標(biāo)記連鎖評估 遺傳圖譜實(shí)質(zhì)上是多點(diǎn)重組分析,標(biāo)記間的距離與重組率有著密切的聯(lián)系,距離越近,重組率越小。為了了解染色體交換重組的規(guī)律,可以通過熱圖來分析相鄰標(biāo)記間的重組關(guān)系。連鎖關(guān)系由強(qiáng)到弱分別用黃色、紅色和紫色表示,由圖可知標(biāo)記順序正確(圖6)。

每一行和每一列都是標(biāo)記,2個標(biāo)記間的重組率用小方格表示,重組率從小到大體現(xiàn)在顏色上是從黃到紅到紫的變化。

3 結(jié)論與討論

遺傳圖譜對遺傳研究、分子標(biāo)記輔助育種以及QTL定位提供了重要的基礎(chǔ),遺傳圖譜的通用性和適用性決定于所包含的標(biāo)記類型和數(shù)量。SNP標(biāo)記作為高密度的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記,為許多物種構(gòu)建高密度遺傳圖譜提供了條件[16-18]。

SLAF-seq技術(shù)適合于快速、大量的開發(fā)SNP標(biāo)記,是位點(diǎn)特異性擴(kuò)增和高通量測序技術(shù)的結(jié)合,為了確保高效的開發(fā)高密度,分布均勻的標(biāo)記,其根據(jù)研究對象參考基因組特點(diǎn)設(shè)計(jì)測序方案,目前已經(jīng)在許多作物上得到應(yīng)用[19-23]。近年來,栽培草莓SNP標(biāo)記遺傳圖譜的構(gòu)建研究也取得了一定的進(jìn)展。2015年,Bassil等[9]在栽培草莓中獲得了6 594個標(biāo)記定位的總圖距2 050 cM的SNP圖譜,Davik等[24]獲得了902個標(biāo)記定位的總圖距1 581.5 cM的SNP圖譜。2017年,Nagano等[10]在栽培草莓中獲得了11 574個標(biāo)記定位的總圖距2 816.5 cM的SNP和SSR的整合圖譜,Lee等[25]獲得了208個標(biāo)記定位的總圖距800.8 cM的SNP圖譜。2019年,Hossain等[26]在栽培草莓中獲得了1 268個標(biāo)記定位的總圖距2 581.57 cM的SNP圖譜。

本研究獲得了565 919 066 reads,717 881個SLAF標(biāo)簽和2 136 939個SNP標(biāo)記,其中有56 237個SNP為高質(zhì)量標(biāo)記,可用于栽培草莓遺傳圖譜標(biāo)記的定位和構(gòu)建。本研究用HighMap軟件繪制了高密度栽培草莓遺傳圖譜,共28個連鎖群,總長度為4 022.16 cM,定位到圖譜上的SNP標(biāo)記為14 412個,標(biāo)記完整度為99.84%,標(biāo)記間平均距離為0.28 cM,圖譜質(zhì)量明顯優(yōu)于近期報道的栽培草莓遺傳圖譜,研究結(jié)果為栽培草莓研究提供了大量的分子標(biāo)記,也為后期基因的精細(xì)定位、分離以及分子育種提供了重要依據(jù)。