汪芮萱，楊林，魏立彬

(中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

1 介紹

腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥死亡率升高的主要原因[1,2]，因此深入研究轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)更有效的腫瘤治療劑至關(guān)重要。轉(zhuǎn)移的完成與一系列復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程密切相關(guān)：局部浸潤(rùn)，從原發(fā)部位解離，血管浸潤(rùn)，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)以及在遠(yuǎn)處靶器官增殖形成轉(zhuǎn)移灶。這整個(gè)過(guò)程的順利完成離不開(kāi)腫瘤細(xì)胞內(nèi)各種復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，通過(guò)產(chǎn)生遺傳學(xué)和/或表觀遺傳學(xué)的改變，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的存活和增殖[3]。轉(zhuǎn)移的發(fā)生與患者預(yù)后不良，晚期復(fù)發(fā)以及死亡率升高都密切相關(guān)[4]，因此，對(duì)于轉(zhuǎn)移更細(xì)致深入的了解，有助于未來(lái)探索與改進(jìn)相關(guān)的治療方法。當(dāng)細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)脫離時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)缺乏、機(jī)械損傷、免疫反應(yīng)等原因往往會(huì)觸發(fā)一種特殊的凋亡反應(yīng)，這種凋亡被稱為“失巢凋亡”。本文對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中失巢凋亡的分子機(jī)制以及失巢凋亡抗性的產(chǎn)生的機(jī)制和相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行綜述。

2 失巢凋亡的分子機(jī)制

失巢凋亡作為細(xì)胞凋亡的一種，是由內(nèi)源性(線粒體)途徑和外源性(死亡受體)途徑共同調(diào)節(jié)的[5]。

內(nèi)源性途徑：當(dāng)細(xì)胞脫離ECM后，由于DNA損傷或者缺氧等反應(yīng)的發(fā)生形成凋亡信號(hào)，啟動(dòng)內(nèi)源途徑，以維持細(xì)胞的完整性和體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[6,7]。首先，凋亡蛋白Bax和Bak易位到線粒體外膜(Outer mitochondrial membrane，OMM)并在OMM形成寡聚物，使得線粒體的膜電位下降，通透性增強(qiáng)形成一個(gè)孔道[8]，線粒體蛋白(如細(xì)胞色素C)可以通過(guò)該孔道釋放到線粒體外[9-12]。細(xì)胞色素C的釋放能夠觸發(fā)凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)介導(dǎo)的caspase-9和caspase-3激活，從而啟動(dòng)下游蛋白的水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[13]。

外源性途徑：外源性途徑主要通過(guò)細(xì)胞外死亡配體(例如FASL或TRAIL)調(diào)節(jié)，當(dāng)它們結(jié)合到細(xì)胞表面的受體(例如Fas，TNFR1)上時(shí)，引起受體的寡聚化，使得該途徑激活[14]。Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)不具有酶的活性，但有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即羧基端的死亡結(jié)構(gòu)域和氨基端的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Death effected domain，DED)。FADD的DD可以與Fas分子胞漿段內(nèi)的DD相結(jié)合，其DED則可以連接pro-caspase-8的DED部分，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(Death-inducing signaling complex，DISC)[15]。DISC能夠促進(jìn)pro-caspase-8進(jìn)行活性加工，使得活化的caspase-8釋放到細(xì)胞質(zhì)中激活下游caspase-3和caspase-7，啟動(dòng)下游蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[14,16]。

3 失巢凋亡抗性的調(diào)控機(jī)制

3.1 EMT與失巢凋亡抗性

EMT最先由Greenberg和Hay在1982年發(fā)現(xiàn)的一種生物過(guò)程，在該過(guò)程中，上皮極化細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷各種生化修飾，最終轉(zhuǎn)化為非極化細(xì)胞。許多證據(jù)表明，EMT不僅是上皮細(xì)胞獲得活動(dòng)性和侵襲性表型中的關(guān)鍵事件，而且還是失巢凋亡抗性獲得的重要過(guò)程之一[17]。

3.1.1 表面標(biāo)志物的改變

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)生主要體現(xiàn)在各種細(xì)胞表面標(biāo)志物的改變，其中上皮細(xì)胞標(biāo)志物主要有：E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，β連環(huán)素(β-catenin)和緊密連接蛋白(occludin)等，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物主要有：N-鈣粘蛋白(Ncadherin)，中間絲波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)等。E-cadherin作為最經(jīng)典的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在各型EMT中表達(dá)均下降[18]。與E-cadherin相反，N-cadherin在EMT中被上調(diào)，這種鈣黏蛋白由E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)變被稱為“鈣黏蛋白開(kāi)關(guān)”，往往被用于監(jiān)測(cè)EMT的 進(jìn)程[19]。

3.1.2 整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附

整聯(lián)蛋白是一種膜鑲嵌蛋白，是由α和β亞基組成的非共價(jià)二聚體。它的胞外結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別纖連蛋白和層粘連蛋白，通過(guò)與之結(jié)合引起構(gòu)象改變，激活粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase，F(xiàn)AK)等信號(hào)分子，啟動(dòng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合肌動(dòng)蛋白，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外信息的雙向聯(lián)絡(luò)。整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞的粘附對(duì)于EMT的發(fā)生起著決定性的作用，對(duì)于失巢凋亡抗性的產(chǎn)生也至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ITGB4或者ITGA6之后，會(huì)引起失巢凋亡現(xiàn)象的增多[20,21]。除了整聯(lián)蛋白之外，F(xiàn)AK的激活或者過(guò)表達(dá)對(duì)于失巢凋亡抗性的產(chǎn)生也起著至關(guān)重要的作用[22]。

3.2 自噬與失巢凋亡抗性

自噬是一種溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞自我消化的途徑，其作用是為了實(shí)現(xiàn)真核細(xì)胞中受損、老化、功能異常的細(xì)胞器或其他多余細(xì)胞質(zhì)分子的再循環(huán)，并且產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)和能量以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞的存活率[23]。它通過(guò)形成一個(gè)雙膜囊泡，即自噬小體，吞噬細(xì)胞質(zhì)成分，并將其傳遞到溶酶體中進(jìn)行降解。在酵母細(xì)胞中，自噬受30多種自噬相關(guān)基因(ATG)調(diào)控[23]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，Beclin1(ATG6)的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠腫瘤發(fā)生的增加，ATG5或ATG7的缺失會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的積累，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[24,25]，這些說(shuō)明自噬的存在對(duì)于腫瘤發(fā)展有抑制作用。然而，在已建立的腫瘤中，癌細(xì)胞需要利用自噬克服環(huán)境的壓力(例如：營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧和藥物損傷等)，這說(shuō)明自噬在一定情況下卻具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能。由于這種雙重功能，自噬也被稱為癌癥進(jìn)展中的“雙刃劍”[26]。

3.2.1 自噬與EMT

自噬只是最近才與EMT連接。近年來(lái)，一些研究表明，自噬和整聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間存在一定的關(guān)系[27]。細(xì)胞ECM附著位點(diǎn)的整聯(lián)蛋白受體為粘著斑(focal adhesion，F(xiàn)A)的形成提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過(guò)張力改變引起粘著斑蛋白磷酸化狀態(tài)改變，并改變蛋白構(gòu)象，促進(jìn)粘著斑的穩(wěn)定和生長(zhǎng)[28-30]。整合素-ECM粘附的喪失在癌性和非癌性上皮細(xì)胞中均誘導(dǎo)自噬，這有利于失巢凋亡抗性產(chǎn)生，使得腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[31,32]。

綜上所述，自噬可能通過(guò)影響細(xì)胞表型的改變或者影響粘著斑的穩(wěn)定和降解等方面來(lái)影響EMT從而導(dǎo)致失巢凋亡抗性的產(chǎn)生。

3.2.2 自噬與氧化應(yīng)激

在對(duì)于乳腺腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬與蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK) 的活性氧(Reactive oxygen species ，ROS)依賴性活化相關(guān)[31]。目前已經(jīng)證實(shí)，PERK可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞(包括導(dǎo)管癌乳腺癌細(xì)胞、結(jié)直腸腺癌細(xì)胞和高度轉(zhuǎn)移性的人纖維肉瘤細(xì)胞)產(chǎn)生失巢凋亡癥抗性[33]。在ER中錯(cuò)誤折疊的蛋白積累之后，未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)的激酶PERK變得活躍，激活eIF2α[34,35]，使得轉(zhuǎn)錄因子ATF4的上調(diào)，從而促進(jìn)許多細(xì)胞存活途徑存活[36]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ATF4缺陷的人纖維肉瘤細(xì)胞容易發(fā)生失巢凋亡，而當(dāng)恢復(fù)ATF4的表達(dá)時(shí)，失巢凋亡的發(fā)生會(huì)被阻斷，細(xì)胞更容易存活[33]。

3.3 代謝改變與失巢凋亡抗性

細(xì)胞從ECM分離會(huì)引發(fā)一系列代謝改變，例如葡萄糖攝取不足、細(xì)胞ATP含量降低以及線粒體產(chǎn)生的ROS升高等[37]。為了抵抗這些壓力，快速分裂的腫瘤細(xì)胞需要快速的ATP生成，并維持適當(dāng)?shù)难趸€原狀態(tài)以支持細(xì)胞分裂。腫瘤微環(huán)境中氧氣水平和營(yíng)養(yǎng)水平較低[38]，不利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，因此，腫瘤細(xì)胞通過(guò)代謝重編程，以滿足腫瘤生長(zhǎng)的需求。Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞中最典型的代謝表型，即相比于正常的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞會(huì)消耗更多的葡萄糖，而且，腫瘤細(xì)胞的糖酵解速率遠(yuǎn)高于氧化磷酸化速率[39]，這為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供了重要的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。

ROS是線粒體有氧代謝的固有的產(chǎn)物，正常情況下，ROS能夠維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，當(dāng)平衡被打破的時(shí)候，它則有可能促使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在脫離基質(zhì)后，由于ROS的升高，會(huì)激活NF-κB，使得超氧化物歧化酶(Managanese superoxide dismutase，MnSOD)的表達(dá)上調(diào)，MnSOD是一種ROS清除劑，能夠減少ROS的損傷，與原發(fā)性腫瘤相比，MnSOD在轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)水平更高。因此，ROS的清除有助于癌細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡抗性[40]。ROS也可以通過(guò)激活SRC誘導(dǎo)生存信號(hào)產(chǎn)生，活化的SRC可以通過(guò)不依賴配體的方式磷酸化EGFR，從而激活MAPK/ERK和PI3K/Akt途徑，最終導(dǎo)致Bim降解和失巢凋亡抑制，這一說(shuō)法在腸道上皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中均得到了證實(shí)[41,42]。

3.4 生長(zhǎng)因子與失巢凋亡抗性

循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等有助于轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)[43]。由于生長(zhǎng)因子受體能夠激活細(xì)胞存活途徑抑制細(xì)胞死亡途徑，因此生長(zhǎng)因子受體或其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的表達(dá)失控與腫瘤的惡性程度相關(guān)。生長(zhǎng)因子受體的異常調(diào)節(jié)能夠激活生存信號(hào)通路，抑制失巢凋亡從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-α(Transforming growth factor-α，TGF-α)是EGFR的配體，它能夠逆轉(zhuǎn)由于附著喪失引起的Src活性和Bcl-xL表達(dá)下降來(lái)防止腸道上皮細(xì)胞的失巢凋亡[44]；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)通常與轉(zhuǎn)移潛能增加以及患者預(yù)后差相關(guān)，其主要通過(guò)TGF-β1/ Smad信號(hào)傳導(dǎo)在EMT過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[45]。此外，TGF-β1也可以直接激活MAPK途徑，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like growth factors-1，IGF-1)被稱為一種“促生長(zhǎng)因子”，它對(duì)于脫離基質(zhì)的細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[46,47]；血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor，PDGF)也與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，在脫離了ECM的人肺腺癌細(xì)胞中，PDGF的受體能夠激活Src，并激活下游的生存信號(hào)通路[5]。

4 總結(jié)

正常的上皮細(xì)胞存活和增殖依賴于與ECM的粘附，當(dāng)這種粘附被破壞時(shí)，容易引發(fā)失巢凋亡。失巢凋亡受到不同信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，主要通過(guò)內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑激活。EMT的發(fā)生對(duì)于失巢凋亡抗性產(chǎn)生有著一定的促進(jìn)作用，自噬對(duì)于失巢凋亡的影響是個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，其可以通過(guò)影響EMT、氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)答的發(fā)生影響失巢凋亡。細(xì)胞在脫離基質(zhì)的粘附之后也會(huì)引發(fā)一系列的代謝變化，而腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)Warburg效應(yīng)恢復(fù)PPP過(guò)程，也可以通過(guò)MnSOD的表達(dá)減少ROS的損傷或者啟動(dòng)一系列生存信號(hào)途徑以維持細(xì)胞的存活。大多數(shù)癌癥的死亡是由于轉(zhuǎn)移的發(fā)生而不是原發(fā)性腫瘤，而失巢凋亡逃逸是轉(zhuǎn)移發(fā)生的必經(jīng)之路，因此對(duì)于失巢凋亡抗性的機(jī)制研究有助于為癌癥的治療方法提供新的思路。