張聰慧，徐紹業(yè)，秦坤，韓雨，邵曉云,3*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，廣西 桂林 541100；2.桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，廣西 桂林 541100； 3.廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點實驗室，廣西 桂林 541100)

0 引言

蛋白質(zhì)翻譯后修飾參與人體細(xì)胞的生命活動，包括甲基化、磷酸化、泛素化修飾等，其中泛素化修飾在蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)中扮演了重要的修飾方式角色。去泛素化酶通過分開泛素分子和蛋白底物，單個泛素分子重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)中，重新進(jìn)行去泛素化調(diào)節(jié)。BRCC3屬于JAMM金屬結(jié)構(gòu)域家族，是一種損傷應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，在多種組織器官中表達(dá)，參與DNA損傷修復(fù)、免疫調(diào)控等多條通路，影響膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、骨質(zhì)疏松等多種疾病的病理生理過程。本文綜述了近年來關(guān)于去泛素化酶BRCC3在作用機(jī)制和疾病進(jìn)程方面的研究進(jìn)展。

1 基本概念

1.1 泛素

泛素(Ubiquitin，Ub)含有76個氨基酸，存在于結(jié)構(gòu)保守的蛋白家族中，調(diào)節(jié)真核生物體內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)的一系列過程。通過其C端以單體形式與目標(biāo)蛋白上的賴氨酸殘基結(jié)合[1]。泛素通過與其他蛋白的共價結(jié)合來實現(xiàn)其功能，從而改變靶蛋白的穩(wěn)定性和活性。泛素可以識別跨膜蛋白，參與膜泡運(yùn)輸。泛素分子與靶蛋白相結(jié)合發(fā)揮功能通過多個方面參與細(xì)胞生命活動：細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡[2]。

1.2 泛素化與去泛素化(Deubiquitin)

泛素化是指蛋白質(zhì)中的泛素分子標(biāo)記靶蛋白并修飾其活性的過程。泛素化是人類細(xì)胞生命活動中蛋白質(zhì)翻譯修飾的一個重要調(diào)節(jié)方式，是蛋白質(zhì)活性和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。泛素由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶調(diào)節(jié)[1]。泛素化已經(jīng)成為許多生理過程的重要調(diào)節(jié)方式，包括蛋白質(zhì)定位、炎癥免疫、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體內(nèi)吞和運(yùn)輸?shù)?。去泛素化是泛素的逆向過程，是指特異性的水解酶去除與靶蛋白和泛素結(jié)合的泛素分子。

1.3 泛素化酶和去泛素化酶

蛋白質(zhì)的泛素化是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)作用的，該系統(tǒng)被廣泛認(rèn)為是一種通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)各種蛋白質(zhì)表達(dá)功能水平的重要機(jī)制。由泛素、E1、E2和E3、26S蛋白酶體(Proteasome)和泛素解離酶共同組成，E3是通過識別同源底物中的特定序列和結(jié)構(gòu)元件，通過與底物共價修飾來調(diào)節(jié)。E1通過ATP供能激活泛素分子，E2結(jié)合激活的泛素分子，E3識別E2上的靶蛋白并對其進(jìn)行泛素化修飾，在泛素的C端和底物的Lys殘基之間形成異肽鍵[3]。泛素化可以產(chǎn)生得到泛素聚合物中大量的結(jié)構(gòu)信息，生成泛素鏈[4]。多聚泛素化蛋白可被去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes，DUBs)去除。去泛素化酶去除泛素與底物蛋白的連接，將單個的泛素分子從泛素化蛋白底物上剝離，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)重新調(diào)節(jié)[5-7]。26S蛋白酶體是一種可以同時識別Lys48和Lys63位連接的泛素化蛋白，Lys48連接的蛋白質(zhì)泛素化較為常見。通常K48結(jié)合的蛋白會被轉(zhuǎn)移到26s蛋白酶體直接結(jié)合降解；而Lys63連接的多聚泛素化則與蛋白質(zhì)降解無關(guān)，K63位點參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NF-kB、內(nèi)吞自噬等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、核糖體功能等[8,9]。

2 去泛素化酶分類以及BRCC3蛋白

人類基因組編碼近100個去泛素化酶，可劃分為以下五個不同的家族：卵巢腫瘤蛋白酶(Ovarian tumor protease，OUT)，這一類蛋白酶與其他類型去泛素化酶氨基酸序列不 一 樣，與USP家 族 相 似；Josephin域(Josephin domain，MJD)發(fā)現(xiàn)Ataxin-3可以水解泛素溶解酶；泛素C末端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase，UCHs)屬于半胱氨酸蛋白酶；泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease，USP)包括組氨酸盒和賴氨酸盒兩個片段；JAMM/MPN金屬酶(Josephin and JAB1/MPN/MOV34 metalllo enzyme，JAMM)結(jié)構(gòu)域家族，具有MPN序列，能結(jié)合泛素化蛋白上的泛素分子。

JAMM家族由許多鋅依賴性金屬蛋白酶組成，二價鋅離子與2個組氨酸和1個天冬氨酸共價結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)第六種去泛素化酶——單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein)屬于半胱氨酸蛋白酶[10]。目前已知JAMM家族的去泛素化酶至少包含POH1，CSN5，BRCC36，AMSH，AMSH-LP五種。

人BRCC36(BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36，小鼠BRCC3的同源物)屬于去泛素化酶JAMM家族成員之一[1,12,13]，它廣泛表達(dá)于心臟、腦、肌肉、腎臟以及小腸等器官。BRCC36是BRCA1-A和BRISC兩種多蛋白復(fù)合物的催化亞基，前者通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)途徑的選擇來保護(hù)基因組的完整性，后者服務(wù)于細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫信號功能。小鼠BRCC3 (BRCA1-BRCA2-containing complex 3)作為BRCC的亞基之一，有10個轉(zhuǎn)錄物(剪接變異)，3個副核苷類，204個正交物[2,5,11]。BRCC3開放閱讀框架由529個氨基酸組成，該蛋白序列保守性較高。作為一種新的細(xì)胞周期調(diào)控分子，具有去除Lys-63位泛素鏈的特異性活性。

3 去泛素化酶BRCC3及其作用機(jī)制

BRCC3基因是一種損傷應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，廣泛分布于心臟、腦、肌肉、腎臟和小腸等，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控[13]及DNA損傷修復(fù)[14,15]過程，修飾方式和某些心血管疾病[16]、腫瘤的發(fā)生[17]及炎癥小體激活密切相關(guān)[18]。然而BRCC3蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，研究證明BRCC3主要是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。ABRO1是BRCC36異肽酶復(fù)合體(BRISC)的一個亞基，它與E3泛素連接酶WWP2競爭性結(jié)合BRCC3，使得WWP2無法介導(dǎo)BRCC3泛素化，從而保持蛋白穩(wěn)定[19-22]。

人BRCC36(鼠同源物BRCC3)是由BRCC3基因編碼的一種多肽，廣泛表達(dá)于人體的大腦、脾、腎臟等多種器官組織。該蛋白是一種鋅依賴性去泛素化酶(DUBs)，可識別賴氨酸K63位殘基相互連接形成的泛素鏈從而進(jìn)行去泛素化修飾。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[4,5,23]，JAMM家族介導(dǎo)的BRCC36在NF-KB細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、先天免疫、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[11]，細(xì)胞內(nèi)BRCC36主要參與形成BRCC(BRCA1/BRCA2-containing complex)和BRISC(BRCC36 containing isopeptidase complex)兩種蛋白復(fù)合物，與MPN序列結(jié)合介導(dǎo)去泛素化功能，由損傷反應(yīng)BRCA1-Rap80復(fù)合物和Cy-卵胞漿BRCC36異肽酶復(fù)合物(BRISC)兩種不同的蛋白復(fù)合物組成。Feng等[5]在該文中發(fā)現(xiàn)除了BRCA1-A復(fù)合物(包括RAP80、CCDC98/Abraxas、BRCC45/BRE和MERIT40/NBA1外，發(fā)現(xiàn)BRCC36與另一相關(guān)蛋白KIAA0157結(jié)合。該蛋白與CCDC98在N末端序列同源性達(dá)39%，KIAA0157主要定位于胞漿，激活胞漿中的BRCC36，表明支架蛋白參與BRCC36活性的調(diào)節(jié)。目前JAMM類金屬蛋白酶包括POH1(人PAD1同源物，酵母中稱為Rpn11)、CSN5(COP9信號體亞單位)、BRCC36、AMSH/AMSH-LP[24,25]，JAMM需要與多亞基復(fù)合物相互結(jié)合作用才能激發(fā)活性，POH1通過形成26S蛋白酶體可進(jìn)行泛素化修飾、CSN5擁有去泛素化活性需要通過形成COP9信號體，AMSH和AMSH-LP自帶去泛素化活性[2]。BRCC36蛋白需要與其他亞基結(jié)合才能形成泛素化鏈發(fā)揮對蛋白的去泛素化作用，因為沒有與泛素鏈直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[5,26]。

4 去泛素化酶BRCC3的功能

4.1 參與DNA損傷修復(fù)

BRCA1促進(jìn)DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)是通過同源重組來進(jìn)行的，保護(hù)DNA復(fù)制叉[27-30]。在這項研究中表明BRCC36是一種Lys-63鏈特異的DUB，H2A組蛋白是BRCC36的底物之一，BRCC36和DUSP3與DNA損傷反應(yīng)有關(guān)，而USP3屬于USP家族，USP3的缺失可使H2A和H2B發(fā)生泛素化從而保護(hù)DNA免受損傷[5,28,29]。BRCC36的去泛素化活性可在DNA雙鏈斷裂中具有泛素識別和修復(fù)作用，可微調(diào)DNA修復(fù)。BRCC36是使BRCA1-A復(fù)合物有去泛素化活性的亞基，降低BRCC36的去泛素化活性可以減少BRCA1-A在DSB上的積聚，減少積聚有利于DSB末端切除不受BRCA1-A的抑制，DNA修復(fù)即可進(jìn)行[30]。

4.2 參與信號通路泛素化調(diào)節(jié)參與炎癥

泛素由賴氨酸殘基與單體泛素相互作用連接形成泛素鏈，前期通過研究K48和K63賴氨酸發(fā)現(xiàn)K48連接蛋白底物能被蛋白酶體識別降解，K63則是參與蛋白活化和信號傳導(dǎo)。Singh等[31]實驗發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中siRNA轉(zhuǎn)染敲低BRCC36，結(jié)果顯示NLRP3炎癥小體、Caspase-1和IL-1β分泌水平顯著降低，表明BRCC36可以調(diào)節(jié)炎癥小體活性，同時也發(fā)現(xiàn)在OX-LDL誘導(dǎo)刺激下炎癥小體活性激活是通過BRCC36得以實現(xiàn)的，證明了BRCC36可能是參與OX-LDL激活炎癥小體的重要分子。抑制BRCC36去泛素化活性可抑制NLRP3炎癥體的激活，這可能是抑制炎癥發(fā)生的潛在靶點。研究表明BRCC3能夠調(diào)節(jié)NLRP3活性，用G5去泛素化小分子抑制劑可抑制NLRP3的炎性活性，通過去泛素化來調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體，提供了炎癥性疾病潛在的NLRP3泛素化治療靶點[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)BRCC3在帕金森病模型中的表達(dá)增加，用shRNA慢病毒敲除BRCC3可使NLRP3神經(jīng)元炎癥體減少，抑制BRCC3可減少IL-1β的分泌，進(jìn)一步證明NLRP3炎癥的激活的通過去泛素化機(jī)制調(diào)節(jié)的，確定了BRCC3是NLRP3泛素化活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[35]。該研究首次證實BRCC36在HT1080細(xì)胞水平具有抗病毒效應(yīng)且不依賴于去泛素化活性，U3A細(xì)胞中缺少STAT1則不具有抗病毒效應(yīng)，推測BRCC36抗病毒作用可能是依賴STAT1，并發(fā)現(xiàn)BRCC36能與STAT1相互作用，通過USP13上調(diào)STAT1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)BRCC36能夠通過去泛素化酶調(diào)節(jié)STAT1的泛素化[36]。

4.3 參與先天免疫(眼表炎癥)干眼模型中，發(fā)現(xiàn)眼表上皮細(xì)胞一種新的天然免疫途徑

應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激，氧化線粒體DNA能夠通過刺激Caspase-8和BRCC36進(jìn)而激活NLRP3/NLRP6炎性小體。激活的NLRP3和抑制的NLRP6刺激caspase-1的激活，刺激白介素-1β和白介素-18的成熟和分泌[37]。在BRISC中，BRCC3參與去泛素化，從而調(diào)節(jié)不同的靶蛋白，包括NLRP3和1型干擾素(IFN)受體鏈1(IFNAR1)。BRCC3表達(dá)水平降低與NLRP3和白細(xì)胞介素(IL-1β)降低有關(guān)[13,19]。

5 去泛素化酶BRCC3對疾病的影響

5.1 膠質(zhì)細(xì)胞瘤

Humphreys等[38]發(fā)現(xiàn)PARK2是一種E3泛素連接酶，在膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma，GB)中常發(fā)生突變和缺失，PARK2連接酶可以直接通過泛素化調(diào)節(jié)EGFP在蛋白水平上的表達(dá)，通過間接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)mRNA水平的表達(dá)[39]。

BRCC3除了在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用外，還參與細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控等其他細(xì)胞途徑。BRCC3作為BRISC復(fù)合體的一部分，使其底物IFNAR1去泛素化，從而影響干擾素信號。發(fā)現(xiàn)BRCC3突變減弱了IFNAR1的DUB活性，導(dǎo)致AML細(xì)胞中干擾素反應(yīng)減弱。證明BRCC3突變通過削弱IFNAR1的去泛素化和功能使AML細(xì)胞對干擾素α介導(dǎo)的毒性不敏感。在急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中，BRCC3失活導(dǎo)致炎癥小體活性減弱，IL-1β釋放減少，BRCC3突變可使其底物發(fā)生泛素化改變和細(xì)胞因子釋放增加[40]。

5.2 宮頸癌

本研究結(jié)果表明，在宮頸癌組織、HeLa、Siha和C33A宮頸癌細(xì)胞中BRCC3表達(dá)水平均有所升高。BRCC3通過上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平和下調(diào)Vimentin、MMP-2、MMP-9、SNAI1和SNAI2表達(dá)水平。研究結(jié)果提示BRCC3是一個與宮頸癌相關(guān)的癌基因，也可能成為宮頸癌患者診斷、治療和預(yù)后的一種新的治療生物標(biāo)志物[41]。BRCA1基因編碼1863個氨基酸蛋白，BRCA1是早發(fā)性乳腺癌的一個易感基因[31,32]，BRCC3在多種乳腺腫瘤中過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)BRCA1參與卵巢癌凋亡、自噬和耐藥性[33,34]。

5.3 骨質(zhì)疏松

Cai等實驗結(jié)果得到三個可能與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因：BRCC3、UBE2N和UBE2K。骨質(zhì)疏松癥患者分離的成骨細(xì)胞UBE2N和UBE2K mRNA與正常對照組相比無明顯變化，而BRCC3 mRNA顯著升高。此外，BACC3過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)成骨分化受到抑制，且β-catenin表達(dá)降低。表明BRCC3可參與骨質(zhì)疏松發(fā)生分化[42]。

5.4 煙霧病綜合征

煙霧病是由于去除MTCP1/MTCP1NB和BRCC3導(dǎo)致Xq28減少。還發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中BRCC3敲除后，血管生成缺陷，這些缺陷可以通過內(nèi)皮特異性的BRCC3表達(dá)來彌補(bǔ)。這些結(jié)果均表明BRCC3，作為一種去泛素酶，細(xì)胞BRCA1和BRISC復(fù)合體的一部分，在血管生成中起著重要的作用[43]。

5.5 心臟病泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (UPS)

通過靶向降解信號和結(jié)構(gòu)蛋白來影響心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，在早期心臟重塑和病理性肥大中，蛋白酶體抑制可以限制疾病進(jìn)展，通過改變基因、藥物等來增強(qiáng)蛋白酶體活性可改善心肌病和心肌梗死患者由于心臟和UPS功能受損預(yù)后，蛋白酶體抑制劑首次應(yīng)用于檢測UPS在心臟病表型中的作用，可作為新的治療藥物[44]。ABRO1在心肌細(xì)胞中高表達(dá)，心肌梗死時表達(dá)增加，有助于心臟保護(hù)作用[45]。

5.6 鼻咽癌

研究結(jié)果顯示鼻咽癌患者中BRCC3表達(dá)增高，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。敲除BRCC3基因可降低鼻咽癌細(xì)胞的放射抗性，敲除BRCC3基因后，鼻咽癌細(xì)胞增多，DAN修復(fù)能力減弱，細(xì)胞周期停滯與G2/M期，這些發(fā)現(xiàn)提示BRCC3可作為鼻咽癌的預(yù)后生物標(biāo)志物和新治療靶點[8]。

5.7 骨髓增生

異常髓系腫瘤檢測中發(fā)現(xiàn)BRCC3基因體細(xì)胞突變，各種髓系腫瘤中共發(fā)現(xiàn)了28個突變，MDS和MDS/MPN中BRCC3突變更為常見，且BRCC3突變與-γ異常有關(guān)，在MDS和MDS/MPN中發(fā)現(xiàn)了BRCC3新的體細(xì)胞突變和其他BRCA1-A復(fù)雜成分的缺失。小鼠LSK細(xì)胞中BRCC3基因敲除后腫瘤細(xì)胞增加近一倍，轉(zhuǎn)染BRCC3shRNA后造血干細(xì)胞分化能力減弱，BRCC3的突變可促進(jìn)白血病可能與這些病變對腫瘤的影響有關(guān)。這些研究結(jié)果都充分提示BRCC3能夠在治療骨髓增生異常可以發(fā)揮作用[18]。

6 結(jié)語

去泛素化酶家族擁有多個家族成員，BRCC3在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、煙霧病、宮頸癌、心臟病等疾病中發(fā)揮去泛素化作用，進(jìn)而影響細(xì)胞病理生理進(jìn)程，通過綜述去泛素化酶BRCC3的作用機(jī)制及在疾病中的作用，從而有利于將BRCC3作為重要的泛素化靶點基因開發(fā)對應(yīng)的藥物，提供新的治療視角。