程姣姣 阮祥燕* 杜 娟 金鳳羽 李揚(yáng)璐 谷牧青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026)

由于腫瘤學(xué)、非腫瘤學(xué)和個(gè)人因素，女性對(duì)于生育力保護(hù)的需求急劇增加。卵巢刺激后成熟卵母細(xì)胞冷凍、胚胎凍存、卵巢組織凍存是美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)認(rèn)可的生育力保護(hù)方法[1-3]。卵巢組織凍存對(duì)于青春期前女孩以及性腺毒性治療無(wú)法延遲的女性是唯一的生育力保護(hù)方法[2-3]。全球已有超過(guò)200例嬰兒通過(guò)卵巢組織凍存移植技術(shù)誕生[4]，凍存卵巢組織移植后約95%患者的卵巢功能可恢復(fù)至正常，妊娠率可高達(dá)50%，活產(chǎn)率和持續(xù)妊娠率約40%[5]，這些數(shù)據(jù)[6]表明了卵巢組織凍存移植技術(shù)的有效性。

但對(duì)于白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、伯基特淋巴瘤等卵巢攜癌高風(fēng)險(xiǎn)的患者來(lái)說(shuō)[7-9]，卵巢組織移植風(fēng)險(xiǎn)高，可能需要通過(guò)其他方法恢復(fù)生育力。一些團(tuán)隊(duì)[10-11]已經(jīng)為白血病患者進(jìn)行卵巢組織移植且患者成功分娩，未見(jiàn)報(bào)道疾病復(fù)發(fā)。近幾十年，為恢復(fù)生育力，并避免惡性細(xì)胞再移回體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)，世界各地的研究團(tuán)隊(duì)努力開(kāi)發(fā)兩種技術(shù)[9, 12]：體外培養(yǎng)卵巢組織[13]和人工卵巢移植[14-15](transplantable artificial ovary, TAO)。第一個(gè)指的是在體外實(shí)現(xiàn)整個(gè)卵泡發(fā)生過(guò)程，第二個(gè)是將分離的竇前卵泡移植回體內(nèi)的自然環(huán)境。這些技術(shù)可提高所有凍存卵巢的患者的生育力。生育力保護(hù)體外技術(shù)的治療潛力是巨大的，但技術(shù)是有挑戰(zhàn)的。本文主要綜述凍存卵巢組織移植安全性以及避免惡性細(xì)胞再移回體內(nèi)新策略的研究進(jìn)展。

1 卵巢組織凍存與移植概述

2020年，中國(guó)新發(fā)癌癥患者470萬(wàn)例，位居世界第一[16]。隨著腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療以及抗癌技術(shù)的進(jìn)步與提高，癌癥患者的5年生存率也明顯提高[17]。因此癌癥幸存者的生活質(zhì)量以及生育需求越來(lái)越得到重視。胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存、卵巢組織凍存等是常用的生育力保護(hù)技術(shù)。相比于胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存，卵巢組織凍存不需要超促排卵，不延誤患者后續(xù)的治療，一片組織中可凍存成百上千個(gè)卵泡，不僅可以保護(hù)患者的生育力，還可以保護(hù)患者的卵巢內(nèi)分泌功能[18]。此技術(shù)對(duì)于青春期前女童和放化療無(wú)法延遲的女性來(lái)說(shuō)是唯一的生育力保護(hù)技術(shù)[2-3]。

通過(guò)卵巢組織凍存移植技術(shù)，全球首例及第2例嬰兒分別于2004年[19]和2005年[20]誕生。目前全球通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)誕生的嬰兒已超過(guò)200例，近期本團(tuán)隊(duì)報(bào)道了中國(guó)首例患者應(yīng)用此技術(shù)后成功自然妊娠[21]。卵巢組織可移植回卵巢對(duì)應(yīng)的腹膜袋中、剩余的卵巢內(nèi)、剩余的卵巢上，可實(shí)現(xiàn)自然妊娠。如果盆腔經(jīng)歷大劑量的放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)后血管供應(yīng)差，可考慮上臂、大腿、腹肌處的異位移植，但異位移植的成功率低，可能是環(huán)境溫度的不適應(yīng)。移植的卵巢組織活性平均可持續(xù)2～5年，目前報(bào)道最長(zhǎng)7年[5]。卵巢組織的存活時(shí)間與患者凍存時(shí)的年齡以及當(dāng)時(shí)的卵巢儲(chǔ)備功能等有關(guān)。

成人卵巢組織凍存移植的適應(yīng)證中最常見(jiàn)的是血液惡性疾病(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病)和乳腺癌[2]。在兒童中，白血病和骨髓增生異常疾病往往占主導(dǎo)地位，其次是肉瘤[22]。到目前為止，還沒(méi)有出現(xiàn)與卵巢組織移植相關(guān)的復(fù)發(fā)病例，再次引入惡性細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)很低。因此，卵巢組織凍存移植技術(shù)是安全的，在目前的適應(yīng)證下不會(huì)對(duì)健康構(gòu)成威脅。

2 卵巢組織移植再攜入癌細(xì)胞的高風(fēng)險(xiǎn)疾病

對(duì)于患有白血病、伯基特淋巴瘤等疾病的患者，卵巢組織中存在惡性細(xì)胞或者微小殘留疾病(minimal residual disease, MRD)的可能性較高，尤其是在診斷時(shí)血液循環(huán)中有惡性細(xì)胞。多項(xiàng)研究[23-24]也已表明了白血病患者卵巢組織凍存、復(fù)蘇與移植攜癌風(fēng)險(xiǎn)很高。但目前卵巢組織凍存仍然是新診斷為白血病的患者保護(hù)生育力的主要策略，當(dāng)患者開(kāi)始化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)后就不能采用胚胎或卵母細(xì)胞凍存了，但化療通常需要在診斷后立即開(kāi)始。相比于凍卵，在化療開(kāi)始后收集卵巢組織是可能的，因?yàn)榉巧L(zhǎng)的卵泡是靜止的，對(duì)化療的致畸性損傷不敏感[25]。

已有研究[10]顯示，白血病幸存者可通過(guò)卵巢組織移植后分娩且沒(méi)有后續(xù)疾病復(fù)發(fā)。卵巢組織取材盡可能是在最安全的時(shí)間，一般傾向于完全緩解時(shí)。血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，在患者對(duì)治療出現(xiàn)反應(yīng)后，以及在疾病負(fù)擔(dān)或微小殘留疾病已大大減少時(shí)收集組織，可將卵巢組織的潛在惡性污染降至最低[26]。在一系列研究中，31例接受了凍融卵巢組織自體移植的患者中有22例(71%)在組織取材前有過(guò)化療暴露。自體卵巢組織移植后3年累積妊娠率總計(jì)為36%(95%CI為17.4～63.7)，其中49%的患者有過(guò)先前的化療暴露，與無(wú)先前化療暴露的患者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[27]。當(dāng)然，即使從完全緩解的患者身上取出用于凍存的卵巢，也不能完全排除攜癌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)[9, 28]。未來(lái)如能有不需要卵巢組織移植而能利用凍存卵巢組織的技術(shù)，如始基卵泡的體外成熟[29]以及可移植的人工卵巢[30]，可明顯提高卵巢攜癌風(fēng)險(xiǎn)高的患者的生育力保護(hù)。

從凍存的卵巢組織中分離無(wú)白血病細(xì)胞的未成熟卵泡被認(rèn)為是可行的。然而，始基卵泡的體外成熟或者它們?cè)谌嗽炻殉仓械囊浦材壳斑€未用于人類(lèi)，也不能作為自體移植的替代[13]。當(dāng)白血病幸存者考慮卵巢組織移植時(shí)，詳盡的組織評(píng)估對(duì)于提高移植安全性是必要的[26]。而且，患者需知曉目前檢測(cè)技術(shù)的局限以及個(gè)體權(quán)衡想要生物學(xué)后代的愿望與疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[25]。

3 避免惡性細(xì)胞再移回體內(nèi)的新策略

全球研究團(tuán)隊(duì)一直致力于開(kāi)發(fā)兩種可安全恢復(fù)無(wú)法進(jìn)行卵巢組織移植患者的生殖功能的技術(shù)：(1)分離的竇前卵泡以可移植人工卵巢的形式移植回體內(nèi)生長(zhǎng)[30]；(2)分離卵泡的體外生長(zhǎng)[29]?；旧希@兩種技術(shù)方法都是將竇前卵泡從卵巢組織中分離出來(lái)，然后在體內(nèi)或體外進(jìn)行卵泡發(fā)育。

3.1 可移植的人工卵巢

人工卵巢是天然卵巢的臨時(shí)替代物，分離的卵泡和卵巢基質(zhì)細(xì)胞包裹在生物材料中。主要目標(biāo)是安全的移植卵巢卵泡，確保性激素的分泌和可受精的成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育。為了設(shè)計(jì)人工卵巢，最重要的是卵泡。因此，在患者開(kāi)始癌癥治療之前對(duì)卵巢組織進(jìn)行取材，可進(jìn)行卵巢組織凍存，也可以用來(lái)分離可凍存的竇前卵泡。無(wú)論何種卵泡分離方法，均需要鑒定細(xì)胞懸液中有無(wú)惡性細(xì)胞[31-32]。為此，Soares等[33]設(shè)計(jì)了一種采用重復(fù)洗滌過(guò)程來(lái)清除惡性細(xì)胞的特定方案。人工卵巢的第二個(gè)組成部分是卵巢細(xì)胞，當(dāng)患者痊愈時(shí)，新鮮的間質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞可以從癌癥治療后的第二次卵巢取材中收集[34]。也可以分離凍存卵巢組織中的卵巢細(xì)胞，但采集新鮮卵巢組織中的卵巢細(xì)胞可避免將惡性細(xì)胞添加到人造卵巢基質(zhì)中，而且凍存后的卵巢細(xì)胞可能沒(méi)有新鮮卵巢組織中的卵巢細(xì)胞有活力，雖然化療會(huì)損傷卵母細(xì)胞的存活和發(fā)育，但似乎對(duì)卵巢細(xì)胞沒(méi)有負(fù)面影響[15]。卵泡和卵巢細(xì)胞將被包裹在一個(gè)基質(zhì)中，基質(zhì)主要是為了給卵泡提供結(jié)構(gòu)性支持，且便于處理和移植。因此，這3個(gè)部分將組成人工卵巢，在癌癥治愈后可移植回患者體內(nèi)。

生理上，卵巢中所有卵泡周?chē)幸粚犹厥獾募?xì)胞外基質(zhì)，即基底膜。在成人的卵巢卵泡中，基底膜主要由IV型膠原、層粘連蛋白以及少量的纖維連接蛋白和蛋白多糖組成[35]，在卵泡發(fā)育過(guò)程中其組成和厚度也在變化[36]?；啄さ拇嬖诳煞乐孤雅荼粣盒约?xì)胞污染。從卵巢組織中應(yīng)盡可能多的分離出完整卵泡，人原始卵泡和初級(jí)卵泡主要分布在卵巢皮質(zhì)中，其非常致密，富含膠原，安全有效地卵泡分離程序現(xiàn)在對(duì)人類(lèi)應(yīng)用是可行的，為了獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的卵泡，最有效的方法通常依賴于機(jī)械和酶組織消化的組合[37]。分離過(guò)程中注意保持卵泡基底膜的完整性，可以通過(guò)顯微鏡監(jiān)測(cè)。Chiti等[38]優(yōu)化卵泡分離方案，將卵巢組織消化分成3個(gè)時(shí)間段(30、60和90 min)，采用的方法為機(jī)械法和酶消化法(Liberase DH和DNase I)，并引入過(guò)濾以取出已分離的卵泡，然后進(jìn)一步分離未消化的組織片段，總體上獲得了更高的卵泡產(chǎn)量，移植一周后卵泡恢復(fù)率(35%)高于之前的研究(20%)[39]。

早期卵泡發(fā)育受卵巢自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)因子的控制，并且已知基質(zhì)細(xì)胞釋放各種正向調(diào)節(jié)原始卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)變的因子。在原始卵泡被激活后，初級(jí)卵泡分泌其他因子來(lái)招募基質(zhì)細(xì)胞分化為功能性膜細(xì)胞，這些細(xì)胞參與卵泡的生長(zhǎng)，并為顆粒細(xì)胞合成雌激素提供類(lèi)固醇合成前體。因此，將卵巢基質(zhì)細(xì)胞添加到人工卵巢中可以重建卵泡和周?chē)|(zhì)細(xì)胞之間的交互作用，潛在地促進(jìn)卵泡發(fā)育。血管化也是卵泡存活和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，因此移植后血管發(fā)育是必需的[40]。內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)移植后的血運(yùn)重建來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活，分離的內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共移植可促進(jìn)移植組織的血管化[41]?？傊?，分離的卵巢細(xì)胞具有體內(nèi)增殖、降解支架和合成新的細(xì)胞外基質(zhì)的潛能，使其能夠在人工卵巢中為分離的卵泡提供結(jié)構(gòu)支持。

人工卵巢的支架在植入后應(yīng)該具有生物相容性和可降解性，以便卵泡能夠發(fā)育、遷移、增殖和血管生成[42]。此外，支架材料必須符合生物安全和臨床兼容標(biāo)準(zhǔn)。從廣泛的生物材料中開(kāi)發(fā)合適的支架來(lái)包裹卵泡并支持其發(fā)育仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵泡從原始卵泡(0.03 mm)到成熟卵泡(18～24 mm)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，需要大量的卵巢細(xì)胞和血管來(lái)支持卵泡發(fā)育。天然的支架材料包括海藻酸鈉、膠原、纖維蛋白、血漿凝塊以及脫細(xì)胞卵巢細(xì)胞外基質(zhì)，合成的材料如聚乙二醇[30]。合成聚合物允許為臨床應(yīng)用量身定做機(jī)械性能，但它們不包含細(xì)胞黏附所需的分子，盡管可以添加生物活性因子來(lái)刺激細(xì)胞黏附。相反，天然聚合物含有生物功能分子，顯示出與細(xì)胞良好的相互作用，在細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化過(guò)程中起重要作用[43]。

一種采用小鼠原始卵泡制作的新型3D打印人工卵巢已被證明可用在小鼠身上并成功分娩健康幼崽[44]。目前需要進(jìn)一步的研究將技術(shù)應(yīng)用于制造人類(lèi)的人工卵巢并將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐。為了更好地應(yīng)用人工卵巢，需要更深入地了解冷凍保存后卵巢的力學(xué)、生物化學(xué)特性和卵泡發(fā)生，更好的體內(nèi)成像技術(shù)來(lái)觀察移植支架的血管化和降解，才能有效地進(jìn)行臨床應(yīng)用[43]。

3.2 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)始基卵泡是另一項(xiàng)新技術(shù)，也避免了自體移植攜癌風(fēng)險(xiǎn)高的卵巢組織。凍存的卵巢組織中主要含有原始卵泡，但也提供了從小的竇卵泡中獲得未成熟卵母細(xì)胞的可能。因此，在不適合移植的情況下，通過(guò)從生長(zhǎng)中的卵泡中提取卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟(in vitro maturation, IVM)，或者通過(guò)原始卵泡的完全體外生長(zhǎng)(in vitro growth, IVG)和成熟(IVGM)為第二次減數(shù)分裂中期(MII)卵母細(xì)胞，可以在體外安全地恢復(fù)生育力。IVM和IVG方法的發(fā)展可以支持卵巢組織中所有階段的卵母細(xì)胞，將最大限度地發(fā)揮所有接受生育力保護(hù)的患者的潛力[45]。但這一領(lǐng)域的進(jìn)展是謹(jǐn)慎的，要找到最佳的培養(yǎng)基和條件來(lái)促進(jìn)人始基卵泡的高效體外培養(yǎng)是一項(xiàng)艱巨的工作。

IVG和IVGM以及隨后體外受精(in vitro fertilization, IVF)已成功應(yīng)用在小鼠上并成功分娩其后代[46]。成功的小鼠卵母細(xì)胞/卵泡IVG系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)突出了對(duì)支持人類(lèi)卵泡IVG的多步培養(yǎng)系統(tǒng)的需求。卵泡發(fā)育的每個(gè)階段，從原始卵泡激活生長(zhǎng)到成熟，都需要不斷變化的條件，因此需要一個(gè)動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)支持3個(gè)主要的過(guò)渡步驟：①始基卵泡的激活；②生長(zhǎng)卵泡的分離和培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育；③卵泡環(huán)境的去除和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的成熟。IVM已成功應(yīng)用于人類(lèi)卵母細(xì)胞，并取得了不同程度的進(jìn)展[47-48]。任何IVG系統(tǒng)的終點(diǎn)都是產(chǎn)生具有發(fā)育能力和表觀遺傳學(xué)正常的卵母細(xì)胞；因此，未來(lái)的研究需要集中于優(yōu)化每個(gè)階段，并進(jìn)一步了解IVG卵母細(xì)胞和任何形成的胚胎的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)。McLaughlin等[49]已經(jīng)成功地使人類(lèi)始基卵泡生長(zhǎng)和成熟到竇前、竇卵泡和MII期，提供了證明人類(lèi)卵母細(xì)胞的完全發(fā)育可以在體外發(fā)生的概念。IVG卵母細(xì)胞的形態(tài)評(píng)價(jià)和受精潛力需要進(jìn)一步優(yōu)化，以確定其是否正常。不同年齡和青春期成熟階段的卵泡數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，青春期前女孩的卵泡在體外表現(xiàn)出與成人不同的生長(zhǎng)軌跡[50]，為成人組織開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)可能不適合青春期前女孩，需要針對(duì)特定年齡段調(diào)整和完善培養(yǎng)體系。因此，體外培養(yǎng)在臨床應(yīng)用之前還需要做更多的工作。

4 小結(jié)與展望

現(xiàn)在有足夠的證據(jù)支持卵巢組織凍存和移植以恢復(fù)生育力的可行性和有效性。然而，一些擔(dān)憂仍然阻礙了卵巢組織移植在所有患者中的應(yīng)用。在一些癌癥中，存在將惡性細(xì)胞與卵巢組織一起重新移植入體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，研究人員已經(jīng)制定了許多策略來(lái)解決這些問(wèn)題?？梢浦踩斯ぢ殉驳某晒υ诤艽蟪潭壬先Q于對(duì)卵泡發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制的理解，以及卵泡與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以維持和發(fā)育合適的卵泡。因此，找到最合適的支架來(lái)容納分離的卵泡是至關(guān)重要的。另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是在臨床應(yīng)用之前，確定分離和移植對(duì)人類(lèi)卵泡是否有表觀遺傳學(xué)影響。人工卵巢還有其他重要用途，例如，可以輔助對(duì)卵泡發(fā)育的理解，以及在毒性學(xué)研究中的應(yīng)用可解釋不同藥物對(duì)生殖的影響。它還可以為研究卵原干細(xì)胞和評(píng)估它們重新啟動(dòng)人類(lèi)配子發(fā)生的能力提供一個(gè)合適的環(huán)境。人工卵巢的發(fā)展將是生殖組織工程領(lǐng)域的革命性一步。

如果可靠的方法能夠體外產(chǎn)生可受精的成熟的人卵母細(xì)胞，這將是一個(gè)可行的替代自體卵巢組織移植的方法。除了各種IVG系統(tǒng)的臨床意義和潛力外，它們中的每一個(gè)系統(tǒng)都提供了進(jìn)入人類(lèi)卵子發(fā)生過(guò)程的實(shí)驗(yàn)上容易處理的輔助樣本。通過(guò)這些系統(tǒng)，我們將更好地了解人類(lèi)卵母細(xì)胞的發(fā)育，最終改善生育力的保存。