李康路，黃漢記，嚴(yán)國(guó)華，譚曼利，黃大計(jì)，朱博

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2. 廣西百色市人民醫(yī)院，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬西南醫(yī)院，廣西 百色 533000)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一，多見于兒童、青少年，具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性、進(jìn)展迅速和化療耐藥等特點(diǎn)[1 ]。近年來(lái)，多藥化療加上手術(shù)切除可發(fā)現(xiàn)的病灶，已使局限性O(shè)S患者的長(zhǎng)期生存率提高到65%～70%[2]。然而，目前由于早期診斷不足和缺乏有效的治療方法，OS患者的5年生存率和預(yù)后仍未明顯改善，尤其是對(duì)多藥耐藥、復(fù)發(fā)或肺轉(zhuǎn)移的患者[3]。因此，迫切需要識(shí)別新的臨床相關(guān)預(yù)后生物標(biāo)志物，并探索腫瘤發(fā)生的潛在分子機(jī)制，以制定更有效的策略來(lái)治療OS。環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種高度穩(wěn)定、保守的特殊RNA，具有共價(jià)閉環(huán)特性，不易被內(nèi)切酶降解，廣泛存在于各種組織和器官中[4]。越來(lái)越多的研究表明，circRNAs以多種方式廣泛參與疾病的發(fā)生發(fā)展，在癌癥中具有重要的作用[5]，它們通過(guò)靶向許多不同基因或信號(hào)通路，并將相關(guān)基因緊密連接到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化和其他生物學(xué)過(guò)程[6]。然而，在OS中，circRNAs的潛在分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們主要探討了環(huán)狀RNA hsa_circ_0003568在OS中的表達(dá)并進(jìn)行生物信息學(xué)研究，以明確其表達(dá)和臨床意義，為進(jìn)行OS分子標(biāo)志物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床對(duì)OS的診斷和治療提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 正常成骨細(xì)胞hFOB1.19、OS細(xì)胞系SJSA-1和HOS購(gòu)買于深圳市豪地華拓生物科技有限公司(中國(guó)，深圳)；胎牛血清購(gòu)自杭州天杭生物公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司(美國(guó)，馬薩諸塞州)；TRIzol試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司(美國(guó)，加利福尼亞州)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green PCR mix購(gòu)自TAKARA生物技術(shù)公司(日本，東京)；實(shí)時(shí)定量 PCR儀(LightCycler 9600)購(gòu)自羅氏公司 (瑞士，巴塞爾)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) hFOB1.19細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，加入G418(0.3 mg/ml)以及青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)，SJSA-1和HOS細(xì)胞系用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d換新鮮的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)按1∶3比例傳代。

1.2.2 RNA 提取和RT-qPCR 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR green PCR mix及hsa_circ_0003568的divergent引物進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃ 10 min，變性 95℃ 15 s，退火 60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算hsa_circ_0003568相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序分析鑒定，測(cè)序由上海生工公司(Sangon Biotech (Shanghai) Co.，Ltd.)完成，引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)circRNA的靶miRNA預(yù)測(cè)工具Circular RNA Interactome(https：//circinteractome.nia.nih.gov/index.html)、CircBank Database(http：//www.circbank.cn/index.html)和RegRNA2.0(http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)預(yù)測(cè)與hsa_circ_0003568相互作用的miRNA，并將其進(jìn)行交集取3個(gè)預(yù)測(cè)工具同時(shí)靶向的miRNA，采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具miRDB(http：//mirdb.org/)、DIANA TOOLS(http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index)、TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_71/)和RegRNA2.0(http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)對(duì)交集到的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并將其進(jìn)行交集取4個(gè)預(yù)測(cè)工具同時(shí)預(yù)測(cè)到的靶基因。通過(guò)GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)對(duì)其交集的靶基因進(jìn)行生存分析篩選生存預(yù)后顯著差異的靶基因(P<0.05)。通過(guò)篩選的circRNA-miRNA和miRNA-mRNA利用Cytoscape構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0003568在OS細(xì)胞中的表達(dá) 我們通過(guò)RT-qPCR在人OS細(xì)胞系(SJSA-1及HOS)和人成骨細(xì)胞系(hFOB1.19)中檢測(cè)了hsa_circ_0003568的表達(dá)。結(jié)果顯示，與成骨細(xì)胞相比，在人OS細(xì)胞系中hsa_circ_0003568的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1A，并通過(guò)sanger測(cè)序驗(yàn)證了hsa_circ_0003568成環(huán)的連接點(diǎn)為IST1前體RNA的第6和第7外顯子相接而成，見圖1B。

2.2 hsa_circ_0003568靶向miRNA的預(yù)測(cè) 為探索hsa_circ_0003568的高表達(dá)在OS中的作用機(jī)制，我們通過(guò)miRNA預(yù)測(cè)工具對(duì)hsa_circ_0003568靶向的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到9個(gè)miRNA，CircBank預(yù)測(cè)到11個(gè)miRNA和RegRNA2.0預(yù)測(cè)到20個(gè)miRNA。對(duì)其預(yù)測(cè)的miRNA進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)3個(gè)預(yù)測(cè)工具同時(shí)預(yù)測(cè)到的2個(gè)miRNA為miR-140-3p和miR-502-5p，見圖2。

2.3 miRNA靶向基因的預(yù)測(cè)及分析 研究已經(jīng)證明miRNA主要是通過(guò)調(diào)控其靶基因而發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。因此，我們通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具分別對(duì)miR-140-3p和miR-502-5p進(jìn)行潛在的靶基因預(yù)測(cè)。對(duì)miR-140-3p靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miRDB預(yù)測(cè)到697個(gè)靶基因，DIANA預(yù)測(cè)到881個(gè)靶基因，TargetScan預(yù)測(cè)到495個(gè)靶基因和RegRNA2.0預(yù)測(cè)到228個(gè)靶基因。進(jìn)一步對(duì)其預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)4個(gè)預(yù)測(cè)工具同時(shí)預(yù)測(cè)到7個(gè)潛在的靶基因(ACVR2B、NFYA、CDK6、VKORC1L1、NRIP1、DAZAP2、KIF5A)，見圖3。對(duì)miR-502-5p靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miRDB預(yù)測(cè)到457個(gè)靶基因，DIANA預(yù)測(cè)到782個(gè)靶基因，TargetScan預(yù)測(cè)到4120個(gè)靶基因和RegRNA2.0預(yù)測(cè)到74個(gè)靶基因。進(jìn)一步對(duì)其預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)4個(gè)預(yù)測(cè)工具同時(shí)預(yù)測(cè)到6個(gè)潛在的靶基因(ODF4、RAB1B、HOXC8、TNRC6C、NFYA、B3GALT5)，見圖4。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)NFYA基因同時(shí)是miR-140-3p和miR-502-5p的潛在靶基因。

注：A：RT-qPCR的結(jié)果，*：P<0.05，**：P<0.01；B：has_circ_0003568形成示意圖及其PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。

圖2 has_circ_0003568靶向的miRNA：CircInteractome、CircBank和RegRNA2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的has_circ_0003568靶miRNA重疊的示意圖

圖3 miR-140-3p靶向的mRNA：DIANA、TargetScan、miRDB和miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miR-140-3p靶基因重疊的示意圖

圖4 miR-502-5p靶向的mRNA：DIANA、TargetScan、miRDB和miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miR-502-5p靶基因重疊的示意圖

2.4 生存分析 通過(guò)采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-140-3p和miR-502-5p分別交集到的7個(gè)和6個(gè)靶基因進(jìn)行生存分析(見表2和表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了CDF4無(wú)生存曲線記錄外，其余基因都有相關(guān)生存曲線記錄。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)CDK6和NFYA基因與OS患者的生存預(yù)后顯著相關(guān)，與低表達(dá)CDK6的OS病人相比，高表達(dá)CDK6的OS病人展現(xiàn)了更差的預(yù)后(P<0.001)，見圖5A；同樣，與低表達(dá)NFYA的OS病人相比，高表達(dá)NFYA的病人生存率更低(P<0.05)，見圖5B。

表2 miR-140-3p靶基因交集的7個(gè)mRNA的生存分析數(shù)據(jù)

表3 miR-502-5p靶基因交集的6個(gè)mRNA的生存分析數(shù)據(jù)

A：OS標(biāo)本中CDK6基因高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后較差(P<0.001)；B：OS標(biāo)本中NFYA基因高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后較差(P<0.05)。

2.5 構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò) 我們使用環(huán)狀RNA hsa_circ_0003568，及其靶向的2個(gè)miRNA和13個(gè)靶基因用Cytoscape構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖6A。同時(shí)，根據(jù)與生存預(yù)后顯著相關(guān)的mRNA，構(gòu)建了hsa_circ_0003568-miR-140-3p/miR-502-5p-CDK6/NFYA可視化調(diào)控亞網(wǎng)絡(luò)，見圖6B。

A：OS中hsa_circ_0003568-miRNA-mRNA相互作用的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。紅色代表circRNA，藍(lán)色代表miRNA，黃色代表mRNA，粉色代表CDK6和綠色代表NFYA；B：基于有生存預(yù)后潛力的mRNA構(gòu)建hsa_circ_0003568-miRNA-mRNA亞網(wǎng)絡(luò)。紅色代表circRNA，藍(lán)色代表miRNA，黃色代表mRNA。

3 討論

OS是一種常見的骨惡性腫瘤，如何治療OS仍然是困擾人類健康的一大難題。目前OS的治療主要是手術(shù)和化療，但患者預(yù)后仍不理想。盡管先前的研究[8]已經(jīng)表明許多基因與OS的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，然而，OS的分子機(jī)制尚不清楚，闡明OS發(fā)展的分子機(jī)制仍是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)一些非編碼RNA被證實(shí)在OS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。circRNAs代表了一類新的保守內(nèi)源性RNA，通過(guò)發(fā)揮miRNAs海綿作用調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能[9]。與其他非編碼RNA如miRNAs和長(zhǎng)非編碼RNA (long noncoding RNAs，lncRNAs)相比，circRNAs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有高度保守性和高度穩(wěn)定性[10-11]。這些特性使circRNAs有可能成為理想的生物標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)。ceRNA假說(shuō)描述了轉(zhuǎn)錄組中不同類型的編碼成員和非編碼成員如何通過(guò)miRNAs相互通信，競(jìng)爭(zhēng)與miRNAs結(jié)合，然后調(diào)控彼此間的表達(dá)，從而構(gòu)建復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有利于深入了解circRNAs在OS進(jìn)展中的分子機(jī)制[12]。目前，雖然越來(lái)越多的研究人員已經(jīng)開始研究circRNAs的潛在功能，但它們的臨床價(jià)值在很大程度上仍不為人所知。在本研究中，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA hsa_circ_0003568在OS細(xì)胞系中高度表達(dá)，并通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-140-3p和miR-502-5p是hsa_circ_0003568的靶向miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在結(jié)腸直腸癌中起到腫瘤抑制的作用，在體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-140-3p可抑制結(jié)腸直腸癌腫瘤生長(zhǎng)[13]。此外，miR-140-3p也被證明是肺癌的抑癌基因[14]，在肝癌中可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，抑制肝癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。研究還發(fā)現(xiàn)miR-140-3p通過(guò)直接調(diào)控三聯(lián)體基序28的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌的增殖和遷移[16]。由此說(shuō)明，miR-140-3p在許多癌癥中扮演著抑癌作用。同時(shí)，越來(lái)越多的研究表明miR-502-5p也是一種腫瘤抑制因子，可以增強(qiáng)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，在許多癌癥中發(fā)揮重要的抑癌作用，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胃癌、肝癌和非霍奇金淋巴瘤等[17-22]。因此，hsa_circ_0003568在OS中可能通過(guò)抑制miR-140-3p和miR-502-5p的表達(dá)加速了OS的生長(zhǎng)。

本研究還進(jìn)行了生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了miR-140-3p和miR-502-5p的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果表明CDK6及NFYA是miR-140-3p的潛在直接靶點(diǎn)，同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)CDK6及NFYA在OS患者的生存分析中具有顯著的預(yù)后差異。CDK6在細(xì)胞周期進(jìn)程中至關(guān)重要，抑制CDK6會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制的增殖，其途徑是導(dǎo)致不依賴正常細(xì)胞外信號(hào)的增殖，或超越確?；蚪M完整性和穩(wěn)定性的檢查點(diǎn)[23]。CDK6在細(xì)胞進(jìn)展中的作用已經(jīng)在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黏液纖維肉瘤和淋巴惡性腫瘤[24-25]。最近的多項(xiàng)研究表明，NFYA在多種癌癥中的表達(dá)增加與不良預(yù)后相關(guān)，包括肝癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌等[26-28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)增加NFYA的表達(dá)可促進(jìn)OS細(xì)胞的惡性表型[29]。有趣的是，NFYA同時(shí)也是miR-502-5p的潛在靶點(diǎn)，由此暗示hsa_circ_0003568可能通過(guò)海綿抑制miR-140-3p和miR-502-5p調(diào)控CDK6和NFYA的表達(dá)從而參與OS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了hsa_circ_0003568在OS中高表達(dá)以及基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)構(gòu)建了hsa_circ_0003568-miR-140-3p/miR-502-5p-CDK6/NFYA的可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，提示hsa_circ_0003568可能是OS潛在的治療目標(biāo)和預(yù)后的生物標(biāo)志物，為將來(lái)探索其在OS預(yù)后判斷中的作用提供了新的途徑。