李庭樹，黃鎖義

(1. 右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院藥學院，廣西 百色 533000；3. 廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西 百色 533000)

雞骨草(Abruscantoniensis)又名黃頭草、黃仔強、大黃草、豬腰草，該植物主要在分布于廣東、廣西等地。雞骨草全草除其種子外均可入藥，具有利濕退黃，清熱解毒，疏肝止痛等功效[1-2]，雞骨草是一種藥食兩用植物，在春夏潮濕季節(jié)用來煲湯作食療及制作涼茶等[3]。雞骨草藥理作用是多方面的，它涉及到降脂保肝[4-5]、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、增強免疫、抗氧化[6-8]、促進傷口愈合、治療母兒ABO血型[9]不合等多種生物活性。本課題組在前期試驗研究中發(fā)現雞骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物在體外具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的作用[10-12]，本研究通過構建SGC-7901胃癌細胞、BEL-7404肝癌細胞、MCF-7乳腺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，在體內環(huán)境中研究雞骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物對裸鼠皮下移植瘤生長的影響，進而篩選出雞骨草體內具有抗腫瘤作用的提取物，為進一步分離雞骨草抗腫瘤的單體化合物指明方向，以及為這一傳統(tǒng)藥物的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及藥材 胃癌細胞SGC-7901、肝癌細胞BEL-7404、乳腺癌細胞MCF-7均購于中國科學院昆明細胞庫，雞骨草藥材均采購于廣西壯族自治區(qū)百色市田林縣，經右江民族醫(yī)學院覃道光副教授鑒定為豆科植物廣州相思子的干燥全株雞骨草。

1.1.2 實驗動物 45只SPF級BALB/c-nu雌性裸鼠，4周齡，質量12～13 g，購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK(湘)2018-0013，試驗動物質量合格證：No.43006700018940，飼養(yǎng)于SPF級動物房內，裸鼠飼料、水均經高壓滅菌處理并由動物實驗室提供。

1.1.3 主要試劑 DMEM購于美國Gibco公司(批號：C11874600BT)；0.25% 胰酶(EDTA，1×) 購于北京索萊寶科技有限公司(批號：T1350)；GEMINI胎牛血清購于美國GEMINI公司(批號：G24G00J)；1×PBS緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司(批號：P1020-500)；青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司(批號：P1400)；兔抗鼠Bax和兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體購于愛必信(上海)生物科技有限公司(批號：abs830008)；抗體稀釋液購于碧云天生物科技公司(上海)(批號：P0023A)；兔二抗購于Boster生物科技公司(武漢)(批號：A32731)；各種規(guī)格離心管、巴氏滴管滴管Axygen購于USA有限公司，25 cm2細胞培養(yǎng)瓶購于美國Coming有限公司；電子游標卡尺購于上海遠略機電設備有限公司(規(guī)格：0-150)；灌胃針購于上海贊德儀器有限公司(規(guī)格：12#)。

1.2 有效成分的提取 將干燥的雞骨草全株粉碎成粉末狀，共25 kg，取適量雞骨草粉末和95%乙醇以13∶5 體積比混合，按以下方法進行提?。?0℃恒溫水浴加熱回流3次，每次2 h，抽濾，合并濾液，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，得到1 kg乙醇浸膏。乙醇浸膏中加入等體積的純水，形成混懸液，再用乙酸乙酯、正丁醇等溶劑對混懸液依次進行反復萃取，直到溶劑不再顯色即可停止，分別對萃取出來的溶劑進行抽濾、合并乙酸乙酯、正丁醇和水溶劑提取液，用旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，得到各個溶劑浸膏，分別為乙酸乙酯提取物(ethyl qcetate extract，CAE)0.25 kg、正丁醇提取物(n-butanol extract，NBE)0.24 kg、水提取物(water extract，WE)0.25 kg，用真空冷凍干燥機干燥成固體狀，取出，保存于4℃冰箱中備用。

1.3 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞SGC-7901、肝癌細胞BEL-7404、乳腺癌細胞MCF-7用含10%胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在37℃、5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 腫瘤細胞移植 當培養(yǎng)瓶中SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞融合度約80%左右時，用胰酶消化、離心，加入DMEM基礎培養(yǎng)基，將細胞濃度調到1×107個/毫升，將細胞懸液置于保溫盒中帶入SPF級實驗室，用碘伏消毒裸鼠右前肢腋下皮膚，注射前輕輕混勻細胞懸液，使用1 ml注射器，針尖與皮膚呈25°進針，每只0.2 ml注射到小鼠右前肢腋下，注射完后用棉球輕輕按壓進針口防止漏液。第2 d，觀察小鼠的精神狀態(tài)及活動情況，留意接種部位是否發(fā)炎。

1.5 實驗分組及處理 接種后，仔細觀察腫瘤的生長情況，用電子游標卡尺測量裸鼠腫瘤體積的變化，當體積達到50 mm3時，按隨機原則，將每種腫瘤細胞的裸鼠分為10組，每組6只，各組給藥劑量、方式、時間見表1。

表1 動物分組及藥物處理

1.6 觀察和測量 每日觀察記錄小鼠的活動、飲食、飲水、排泄物、精神狀態(tài)以及腫瘤生長情況。給藥后第1 d、4 d、8 d、12 d、16 d、21 d，用電子游標卡尺測量裸鼠腫瘤最長徑和最短徑，腫瘤體積按公式 V(mm3)= a × b2/2計算，a為腫瘤最長直徑(mm)，b為腫瘤最短直徑(mm)。第21 d，采用頸椎脫臼法處死裸鼠，將裸鼠的腫瘤組織剝離，除凈腫瘤組織周圍的結締組織，用生理鹽水將血漬洗掉并用吸水紙吸干表面水分，稱重并按公式計算腫瘤抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%，計算腫瘤的抑瘤率。取瘤組織作常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，HE染色后觀察組織病理學。

1.7 免疫組織化學檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達 取出蠟塊切片后染色。腫瘤組織中Bax和Bcl-2的陽性反應表現為腫瘤組織陽性細胞的細胞膜、細胞質和細胞核的核膜上呈現棕黃色或黃色顆粒。每組選擇2只裸鼠分別檢測1張切片，200倍顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus(IPP)6.0圖像分析系統(tǒng)對隨機拍攝的6個高倍視野圖像進行定量分析，計算積分光密度值(integrate optical density，IOD)，取平均數，即為免疫組化表達的結果。

2 結果

2.1 CAE、NBE、WE對SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 為了研究雞骨草CAE、NBE、WE在體內抗腫瘤的效果，實驗采用SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞注射于裸鼠皮下，形成帶有惡性腫瘤的裸鼠，通過觀察雞骨草CAE、NBE、WE處理后腫瘤生長的快慢、腫瘤體積和瘤重的大小，從而評價雞骨草CAE、NBE、WE體內抗腫瘤的效果。經14 d的觀察與統(tǒng)計，筆者發(fā)現3種腫瘤細胞的腫瘤組織在裸鼠體內的生長受到了雞骨草CAE、NBE、WE的抑制，并呈現出劑量依賴性。對比3株腫瘤細胞在體內生長的情況，結果顯示NBE、CAE對不同的腫瘤細胞在體內生長的抑制強度不同，CAE和NBE對3株腫瘤細胞移植瘤的抑制強度大小為：BEL-7404>SGC-7901>MCF-7，而WE對不同的腫瘤細胞在體內生長的抑制強度基本上是相同的。CAE、NBE、WE在體內抗腫瘤活性大小為：CAE>NBE>WE。

2.2 雞骨草CAE、NBE、WE對SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 雞骨草CAE、NBE、WE處理SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤21 d后，與模型組相比，CAE低、中、高劑量組和NBE中、高劑量組移植瘤體積和瘤重均減小(P<0.05)，抑瘤率與給藥劑量成正比，呈劑量依賴性。和CAE、NBE相比，WE抑瘤效果較弱，僅WE高劑量組的移植瘤體積和瘤重與模型組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖1。CAE、NBE、WE高劑量組對SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分別為43.64%、30.68%、10.68%。折線圖的斜率越大則腫瘤生長越快，斜率越小則腫瘤生長越慢，與模型組相比，CAE、NBE、WE組移植瘤生長緩慢，以CAE組移植瘤生長最慢，見圖2。綜上所述，雞骨草CAE、NBE、WE對SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤生長的抑制強度大小為：CAE>NBE>WE。

表2 CAE、NBE、WE對SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 (n=6)

注：與模型組比較，***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。圖1 CAE、NBE、WE對SGC-7901 細胞裸鼠皮下移植瘤瘤重的影響

圖2 CAE、NBE、WE處理后SGC-7901 細胞裸鼠皮下移植瘤的生長曲線

2.3 雞骨草CAE、NBE、WE對BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 雞骨草CAE、NBE、WE處理BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤21 d后，與模型組相比，CAE組和NBE組移植瘤體積和瘤重均顯著減小(P<0.05)，抑瘤率與給藥劑量成正比，呈劑量依賴性；和CAE、NBE比，WE抑瘤效果較弱，僅WE高劑量組的移植瘤體積和瘤重與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3和圖3。其中CAE、NBE、WE高劑量組對BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分別為47.35%、33.19%、9.29%。與模型組相比，CAE、NBE、WE組移植瘤生長緩慢，以CAE組移植瘤生長最緩慢，見圖4。綜上所述，雞骨草CAE、NBE、WE對BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤生長的抑制強度大小為：CAE>NBE>WE。

表3 CAE、NBE、WE對BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 (n=6)

注：與模型組比較，***P<0.001；**P<0.01； *P<0.05。圖3 CAE、NBE、WE對BEL-7404細胞 裸鼠皮下移植瘤瘤重的影響

圖4 CAE、NBE、WE處理后BEL-7404細胞 裸鼠皮下移植瘤的生長曲線

2.4 雞骨草CAE、NBE、WE對MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 雞骨草CAE、NBE、WE處理MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤21 d后，與模型組相比，CAE低、中、高劑量組和NBE中、高劑量組移植瘤體積和瘤重均減小(P<0.05)，抑瘤率與給藥劑量成正比，呈劑量依賴性。WE和CAE、NBE相比抑瘤效果較弱，僅WE高劑量組的移植瘤體積和瘤重與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4和圖5。其中CAE、NBE、WE高劑量組對MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分別為29.53%、22.22%、6.43%。與模型組相比，CAE、NBE、WE組移植瘤生長緩慢，以CAE組移植瘤生長最緩慢，見圖6。綜上所知，雞骨草CAE、NBE、WE對MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤生長的抑制強度大小為：CAE>NBE>WE。

表4 CAE、NBE、WE對MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 (n=6)

注：與模型組比較，***P<0.001；**P<0.01； *P<0.05。圖5 CAE、NBE、WE對MCF-7細胞 裸鼠皮下移植瘤瘤重的影響

圖6 CAE、NBE、WE處理后MCF-7細胞 裸鼠皮下移植瘤的生長曲線

2.5 HE染色結果 HE染色是組織學中使用最基礎、最廣泛的技術方法之一，常用于組織形態(tài)結構的觀察，在200倍數的光鏡下觀察HE染色。SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤模型組腫瘤細胞均勻、排列密集、生長狀態(tài)良好、細胞核深染、呈圓形或卵圓形、大小不一，腫瘤細胞形態(tài)正常；雞骨草CAE、NBE、WE組腫瘤細胞呈不同程度的彌散性分布、紅染、碎片狀的干酪樣壞死、模糊不清等現象，說明雞骨草CAE、NBE、WE均能使SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤中的腫瘤組織發(fā)生壞死；在同種腫瘤細胞移植瘤的HE染色中，CAE高劑量組腫瘤組織發(fā)生的壞死現象比NBE、WE高劑量組明顯，其中以BEL-7404細胞移植瘤中CAE高劑量組最為明顯，WE高劑量組腫瘤組織發(fā)生的壞死現象比CAE、NBE高劑量組較輕，見圖7～圖9。綜上所述，雞骨草CAE高劑量組誘導SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞移植瘤組織發(fā)生壞死的作用最強，且對BEL-7404細胞移植瘤最敏感，雞骨草WE高劑量組誘導SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞移植瘤組織發(fā)生壞死的作用最弱。

2.6 CAE對BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 Bcl-2和Bax的陽性反應為腫瘤組織陽性細胞的細胞膜、胞質和核膜上出現棕黃色或黃色顆粒，隨著CAE給藥劑量的增大，腫瘤組織Bcl-2陽性細胞減少，Bax陽性細胞增多，腫瘤細胞密度減小。CAE中、高劑量組腫瘤組織Bcl-2蛋白的IOD比模型組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。CAE中、高劑量組腫瘤組織Bax蛋白的IOD比模型組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，CAE低劑量組腫瘤組織Bcl-2、Bax蛋白的IOD和模型組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖10～圖12和表5。Bcl-2/Bax的比值隨著CAE給藥劑量的增大而減小，表明CAE可上調Bcl-2和下調Bax蛋白的表達。

圖7 CAE、NBE、WE對SGC-7901細胞裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)的影響(200×)

圖8 CAE、NBE、WE對BEL-7404細胞裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)的影響(200×)

圖9 CAE、NBE、WE對MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)的影響(200×)

圖10 CAE對BEL-7404細胞腫瘤組織Bcl-2蛋白表達的影響(200×)

圖11 CAE對BEL-7404細胞腫瘤組織Bax蛋白表達的影響(200×)

注：與模型組比較，***P<0.001；**P<0.01。圖12 CAE對BEL-7404細胞腫瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

表5 CAE對BEL-7404細胞腫瘤組織Bcl-2、 Bax蛋白的表達的影響 (n=6)

3 討論

隨著近代醫(yī)學發(fā)展的需求，裸鼠皮下移植瘤模型被建立[13-14]，尤其在腫瘤學、免疫學、藥品與生物制品的安全性評價、有效藥品篩選等實驗方面的應用。裸鼠無毛缺乏胸腺，T淋巴細胞少，無細胞免疫功能，對異體移植物不發(fā)生細胞毒效應或反應甚小，腫瘤移植生長良好，可保持腫瘤細胞原有的形態(tài)和生物學特性，是人源癌細胞異種移植的最佳實驗動物。體內實驗是有效藥品的篩選和研究開發(fā)新藥的依據[15]。在藥物抑制腫瘤的機制研究中，腫瘤細胞的凋亡是一大研究熱點[16]，研究表明[17]，細胞凋亡受到多種基因的調控，是一個多種抑制因素和促進因素共同作用的過程。Bcl-2和Bax是尤為重要的調亡相關基因，Bcl-2是抑制細胞調亡的基因，Bax是促進細胞調亡的基因。有研究表明[18]，Bcl-2和Bax的比值大小決定了細胞是否發(fā)生調亡，Bcl-2高表達時，抑制細胞凋亡，當Bax高表達時，促進細胞凋亡。

雞骨草是民間常用于清利肝膽濕熱的中藥，其復方膠囊在臨床上廣泛應用；抗腫瘤研究也有報道[19]，但雞骨草抗腫瘤的藥效活性單體化合物還未明確。課題組前期研究發(fā)現雞骨草CAE、NBE、WE在體外具有良好的抑瘤效果，且在體內安全性高。本文在課題組前期研究的基礎上對雞骨草CAE、NBE、WE進行體內抗腫瘤活性研究，采用裸鼠作為SGC-7901、BEL-7404、MCF-7 細胞的接種對象，在裸鼠的右前肢腋下的皮下接種SGC-7901、BEL-7404、MCF-7細胞，成瘤率達到100%，治療結束后摘除移植瘤并進行相關的實驗，實驗結果表明：雞骨草CAE低、中、高劑量組和NBE中、高劑量組及WE高劑量組能有效地抑制移植瘤在裸鼠體內的生長，和模型組相比具有統(tǒng)計學意義，以雞骨草CAE抑瘤作用最強。免疫組化Bcl-2、Bax蛋白檢測結果顯示，雞骨草CAE能抑制Bcl-2蛋白的表達，促進Bax蛋白的表達，導致Bcl-2/Bax降低，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本研究揭示了雞骨草體內抗腫瘤作用的物質基礎，對于進一步分離抗腫瘤單體化合物，藥材開發(fā)成抗腫瘤創(chuàng)新藥物奠定基礎。