儲昭陽，朱向明，江峰，劉表虎，李國杰，龔儒杰，馬平川，徐凱慧

(1. 皖南醫(yī)學院研究生院，安徽 蕪湖 241000；2. 皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學科，安徽 蕪湖 241000；3. 浙江省臺州市黃巖區(qū)婦幼保健院超聲醫(yī)學科，浙江 臺州 318020)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)起源于腎上皮，是最常見的腎癌類型[1]，預后差[2]。RCC約占腎癌的90%，其中最常見的組織亞型是腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)[3]。目前根治性切除是KIRC的主要治療方法，其次是放療、化療和靶向治療，然而，即使在成功的治療后，30%的患者出現腫瘤復發(fā)或遠處轉移[4]，因此，探討KIRC的發(fā)生機制和治療方法已迫在眉睫。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的結構成分主要是基質細胞和免疫細胞[5]。本研究應用ESTIMATE和CIBERSORT計算方法[6]，計算了來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫的KIRC樣本的TICs比例和TME中免疫和基質成分的比率，并確定了一個預測性生物標志物：過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1A(PPARGC1A)。最近的一項研究也發(fā)現，PPARGC1A缺乏會引起自發(fā)性腎臟炎癥并增加急性腎損傷(AKI)的嚴重性[7]。本文從KIRC免疫成分和基質成分比較產生的差異表達基因(DEGs)出發(fā)，通過一系列分析揭示PPARGC1A可能是KIRC中TME狀態(tài)改變的潛在指標。

1 材料和方法

1.1 數據準備并進行評分 從TCGA數據庫(https：//portal.gdc.cancer.gov/)下載611例KIRC病例的轉錄組RNA-seq數據(正常樣本72例；腫瘤樣本539例)和相應的臨床數據(年齡、性別、腫瘤分級、病理分期和生存結果)，利用LIMMA軟件包進行歸一化處理，刪除正?；蛑貜偷臉颖綶8]。之后使用R語言4.0.2版本，加載ESTEST軟件包[9]，對每個樣本的TME中免疫、基質成分的比例進行估計，分別表現為免疫評分、基質評分和總評分三種評分形式，它們分別與免疫、基質和兩者的總和的比率正相關，這意味著各自的分數越高，在TME的相應成分的比率越大。

1.2 生存分析及DEGs的提取 使用軟件包Survminer進行生存分析。在539例腫瘤標本中，537例有詳細的生存時間記錄，用于生存分析。緊接著根據與免疫評分和基質評分的中位數的比較，539個腫瘤樣本分別被標記為高分組或低分組。用LIMMA軟件包進行基因表達的差異性分析，通過比較高分樣本和低分樣本產生的DEGs。將log2(Fold change)的絕對值>1.0的DEGs(高分組/低分組)和錯誤發(fā)現率(FDR)<0.05的DEGs視為有統(tǒng)計學意義。

1.3 GO和KEGG富集分析、熱圖及臨床分期與評分的相關性分析 將得到的DEGs進行GO和KEGG富集分析，在R軟件包clusterProfiler、enrichplot和ggplot2的幫助下進行，只有P值和q值均<0.05的通路才被認為是顯著富集。用R語言結合pheatmap軟件包生成DEGs的熱圖，之后從TCGA下載與KIRC標本相對應的臨床病理特征數據。采用R語言進行統(tǒng)計分析，以Wilcoxon秩和檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗為顯著性檢驗，在不同臨床分期之間進行比較。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡(PPI)構建及Cox回歸分析 在String數據庫對得到的DEGs構建PPI網絡，然后用Cytoscape 3.6.1進行重構。利用交互關系置信度>0.40的節(jié)點構建網絡，并對PPI中的主要節(jié)點按其具有相關性的數量多少排序；用R語言對DEGs進行單變量Cox回歸分析。將結果按P值從小到大的順序排序，之后對二者的分析結果取交集。

1.5 目標基因驗證及基因數據集富集分析 運用R語言探討選取的目標基因在腫瘤和正常組織中的表達水平，并根據TCGA-KIRC數據和完整的臨床信息，對目標基因進行生存分析和臨床相關性的分析。然后對所有腫瘤樣品的轉錄組都用于GSEA(基因集富集分析)，使用gsea-4.0.3軟件執(zhí)行GSEA的目標集(C2 KEGG基因數據集v7.1和C7免疫學特征基因數據集v6.2)。只有NOMP<0.05的基因集被認為是有意義的。

1.6 腫瘤浸潤免疫細胞分析 采用CIBERSORT計算方法估計所有腫瘤樣本中的腫瘤浸潤免疫細胞豐度分布，然后進行質量過濾，只選擇P<0.05的腫瘤樣本進行免疫細胞與目標基因的相關性分析。

2 結果

2.1 免疫評分與KIRC患者的生存率相關 為了建立估計的免疫和基質比例與生存率的相關性，分別對免疫評分、基質評分和總評分進行生存分析。免疫評分或基質評分中估計的較高分數代表TME中免疫或基質成分的數量較多?？傇u分是免疫評分和基質評分的總和，表示兩者在TME中的綜合比例。如圖1A所示，免疫成分比例與總體存活率呈負相關。盡管基質評分和總評分與總生存率無顯著相關性(見圖1B、圖1C)。提示TME中的免疫成分更適合作為判斷KIRC患者預后的指標。

注：A：免疫評分；B：基質評分；C：總評分。圖1 免疫評分、基質評分和總評分與KIRC患者存活率的相關性

2.2 免疫評分、基質評分和總評分與KIRC患者的臨床病理分期有關 為了確定免疫成分和基質成分的比例與臨床病理特征之間的關系，我們從TCGA數據庫中分析了KIRC病例的相應臨床信息。免疫評分結果表明，男性的免疫評分高于女性(P=0.015)；在Ⅰ期和Ⅱ期、Ⅰ期和Ⅲ期、Ⅰ期和Ⅳ期中，后者的免疫評分高于前者(P=0.052、0.0004、0.0002)；在T1和T3中， 后者的免疫評分也高于前者(P=0.030)。<65歲組的基質評分高于65歲以上的組(P=0.0064)；T2組的基質評分高于T1組(P=0.040)。 這些結果表明免疫成分和基質成分的比例與KIRC的進展有關。

2.3 免疫評分和基質評分共有的DEGs主要表現為免疫相關基因的富集 為了確定TME中有關免疫和基質成分的基因譜的準確變化，對高分和低分樣本進行了比較分析。與中位數相比，從免疫評分中獲得了569個DEGs(高分與低分的樣本)，其中有466個基因上調，有103個基因下調。同樣，從基質評分獲得312個DEG(215個上調基因和97個下調基因)。相交分析顯示，免疫評分和基質評分中共有44個高分相交的上調基因，和49個低分相交的下調基因。這些DEGs(共93個基因)可能是TME中的決定因素?；虮倔w(GO)富集分析的結果表明，DEGs幾乎映射到與免疫相關的GO通路，例如白細胞增殖和體液免疫反應(見圖2A)。京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析還顯示了原發(fā)性免疫缺陷，細胞因子-細胞因子受體相互作用和造血細胞譜系的富集(見圖2B)。因此，DEGs的整體功能似乎映射在免疫相關活動上，這表明免疫因素的參與或許是KIRC中TME的一個潛在特征。

圖2 對DEGs的GO(A)和KEGG(B)富集分析

2.4 PPI網絡與單變量Cox回歸的交集分析 為了進一步探索其潛在機制，我們使用Cytoscape軟件基于STRING數據庫構建了52個DEGs的93個關系的PPI網絡，并表示了按節(jié)點數排列的前30個DEGs的條形圖(見圖3A)。對KIRC患者的生存進行單因素Cox回歸分析，以確定影響KIRC患者生存的顯著因素(見圖3B)。然后，對PPI網絡中的領先節(jié)點與單變量Cox回歸中P值排名前30位的因素進行交集分析，只有IGLL5、PPARGC1A、MZB1、HSD11B1和TNFSF13B這5個基因重疊 (見圖3C)，通過對這5個基因進一步生存分析發(fā)現，僅有PPARGC1A的表達水平與KIRC患者的預后成正相關。

注：A：按節(jié)點數排序的前30個基因；B：單因素Cox回歸分析； C：顯示PPI中前30個節(jié)點和單變量Cox中最顯著因子的Venn圖。圖3 PPI網絡與單變量Cox回歸分析

2.5 PPARGC1A表達與KIRC患者生存期及TNM分期的關系 PPARGC1A在B細胞的增殖和分化中起重要作用。在本研究中，將所有KIRC樣本分為PPARGC1A高表達組和PPARGC1A低表達組，并與PPARGC1A中位值進行比較表達式生存分析顯示，PPARGC1A高表達的KIRC患者的生存率高于PPARGC1A低表達患者(見圖4A)。之后，Wilcoxon秩和檢驗分析顯示腫瘤樣本中PPARGC1A的表達顯著低于正常樣本(見圖4B)。在來自同一患者的正常組織和腫瘤組織的配對分析中也觀察到類似的結果(見圖4C)。以上結果表明，TME中PPARGC1A的表達與KIRC的預后呈正相關，病人PPARGC1A的表達隨TNM分期的進展而降低，特別的是，PPARGC1A的表達在不同年齡組及性別之間無明顯相關性。

注：A：PPARGC1A高低表達患者的生存分析；B、C：PPARGC1A在標本中的表達。圖4 PPARGC1A在KIRC患者中的表達及生存分析

2.6 PPARGC1A有可能成為TME調制的指標 鑒于PPARGC1A的水平與KIRC患者的生存期和TNM分期的相關性，因此使用GSEA軟件分別應用于高表達和低表達組。如圖5A所示，在C2 kegg v7.1數據集，PPARGC1A高表達組的基因在代謝途徑中富集，例如賴氨酸降解、丙酸酯代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酮酸代謝、丁酸酯代謝、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)、脂肪酸代謝、過氧化物酶體、近端小管碳酸氫鹽回收和ErbB信號通路。對于C7基因集：免疫學特征數據集，多個免疫功能基因集在高PPARGC1A表達組中富集(見圖5B)，例如調節(jié)性T細胞(Treg)、B細胞分化、激活的CD4 T細胞、巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、CD8+T細胞，B淋巴細胞、先天免疫刺激。這些結果表明，PPARGC1A可能是TME中調節(jié)免疫成分的潛在指標。

2.7 PPARGC1A與腫瘤浸潤免疫細胞(TICs)比例的相關性 為了進一步證實PPARGC1A表達與免疫微環(huán)境的相關性，使用CIBERSORT算法分析了腫瘤浸潤免疫亞群的比例，并在KIRC樣品中構建了22種免疫細胞譜(見圖6)。差異和相關分析的交集結果表明，共有9種TICs與PPARGC1A的表達相關(見圖7)。其中5種TICs與PPARGC1A表達呈正相關，包括幼稚B細胞、靜息肥大細胞、CD4記憶靜息T細胞、單核細胞、巨噬細胞M2。4種TICs與PPARGC1A表達呈負相關，包括漿細胞、CD8T細胞、Tfh、Treg。這些結果進一步支持了PPARGC1A的表達水平影響TME的免疫活性。

注：A：高PPARGC1A表達樣品在C2 kegg v7.1數據集中富集的基因集。每條線代表一個

注：小提琴圖顯示PPARGC1A低表達或高表達的KIRC腫瘤標本中21種免疫細胞相對于PPARGC1A表達水平中位數的比值分布，采用Wilcoxon秩和法進行顯著性檢驗。圖6 KIRC腫瘤標本中免疫細胞分布

注：A：散點圖顯示與PPARGC1A表達具有相關性的TICs(P<0.05)。各小區(qū)的藍線

3 討論

作為腎癌中最常見的亞型，KIRC很難治愈[2]，因為缺乏有效用于KIRC治療的治療靶點和分子藥物。在過去的12年里，RCC的醫(yī)療已經從非特異性免疫途徑(在細胞因子時代)過渡到針對血管內皮生長因子(VEGF)的靶向治療，現在已經過渡到新的免疫治療藥物[1，10]。然而，要提高對特定藥物反應的患者選擇仍然是一項主要挑戰(zhàn)，需要更好的生物標志物和預測模型[11]。本研究從高、低免疫、基質評分組的比較中篩選出總共93個相交的DEGs。功能富集分析和KEGG通路分析表明，DEGs在細胞因子-細胞因子受體相互作用和初級免疫缺陷中明顯聚集，暗示與免疫微環(huán)境密切相關。

既往研究指出[7]，PPARGC1A缺乏會引起自發(fā)性腎臟炎癥并增加腎毒性AKI的嚴重性。同樣，我們的結果表明，PPARGC1A在KIRC患者的晚期表達降低。 因此，我們進一步分析了PPARGC1A表達與TME之間的關系。GSEA富集分析結果表明，PPARGC1A高表達組的基因在代謝途徑中顯著富集，尤其在三羧酸循環(huán)中。同位素示蹤顯示，人類透明細胞腎細胞癌的體內葡萄糖氧化受到抑制[12]，因此我們考慮PPARGC1A的高表達通過代謝途徑對KIRC的進展發(fā)揮抑制作用。對于C7基因集：免疫學特征數據集，多個免疫功能基因集在高PPARGC1A表達組中富集，這些結果表明，PPARGC1A可能是TME中調節(jié)免疫成分的潛在指標，并且可能是TME狀態(tài)從免疫顯性向代謝顯性轉變的一個指標。

之后，我們評估了KIRC樣品中22種免疫細胞的獨特浸潤比例。分析表明，幼稚B細胞、單核細胞、巨噬細胞M2與KIRC患者PPARGC1A的表達呈正相關，提示PPARGC1A可能與TME免疫活性狀態(tài)的維持有關。預后不良的高危患者中Tregs和Tfh細胞的比例較高，與PPARGC1A的表達呈負相關。B細胞可被腫瘤細胞激活并分泌免疫球蛋白以抑制腫瘤生長[13]。巨噬細胞M2與抑制免疫反應、細胞外基質重塑和促進血管生成有關的主要功能特性仍然是最重要的，對腫瘤的發(fā)展起到了抑制作用[14]。長期以來，Tregs被認為是免疫抑制抑制的主要因素，并被認為與預后不良有關[15-16]。并且，據報道，Tregs對KIRC的預后具有反常的負面作用[17]。在本研究中發(fā)現表明，幼稚B細胞、巨噬細胞M2在KIRC發(fā)展過程中也可能發(fā)揮保護作用，Tregs在KIRC預后中可能發(fā)揮負面作用，Tfh細胞也可能發(fā)揮負面作用，PPARGC1A的表達提高可能會降低KIRC患者Tregs、Tfh細胞水平。

總之，根據基于ESTIMATE算法的免疫和基質評分，鑒定了93個TME相關DEGs。功能富集分析進一步表明，PPARGC1A可能是TME狀態(tài)從免疫顯性向代謝顯性轉變的一個指標。然后通過一系列分析得出PPARGC1A可能作為評估KIRC患者預后的樞紐基因，使用CIBERSORT評估了高危和低危人群之間22種與PPARGC1A相關的TICs的比例及其相關性。本研究表明，TME的免疫成分影響KIRC患者的臨床結局，并可能基于PPARGC1A為KIRC患者開發(fā)新的免疫療法提供基礎。