黃桔，李曉文，蔣艷平，龍文清，周越菡

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541199；2. 桂林醫(yī)學(xué)院臨桂臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199)

膠質(zhì)瘤(Glioma)是最常見的起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的原發(fā)性惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40%[1]。作為最嚴(yán)重的惡性星形細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤細(xì)胞無限增殖，并侵襲鄰近的大腦結(jié)構(gòu)且易轉(zhuǎn)移[2]。目前，臨床上治療膠質(zhì)瘤主要以替莫唑胺為基礎(chǔ)化療藥物，結(jié)合手術(shù)切除和放療[3-5]。然而，即使多種治療手段聯(lián)合應(yīng)用，療效依然欠佳，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然很差，并具有較高的復(fù)發(fā)率[6]。因此，開發(fā)治療效果好且高效的抗膠質(zhì)瘤藥物具有極其重要的意義。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AND)是源于爵床科植物穿心蓮(Andrographispaniculata)的一種二萜內(nèi)酯化合物。臨床上被用作抗炎和抗感染藥物[7-8]。近年來，許多研究顯示AND可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡[9]。目前AND對(duì)治療膠質(zhì)瘤的研究非常有限，且AND對(duì)膠質(zhì)瘤的作用鮮有報(bào)道。

本研究主要以人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87-MG為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察AND對(duì)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞體外生長(zhǎng)的作用，探討AND對(duì)線粒體膜電位及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的影響，并觀察AND對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討AND對(duì)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的可能機(jī)制，以期為民族醫(yī)藥在膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用中提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 藥物與試劑 AND(純度98%，貨號(hào)365645)購自Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)C1199-5500BT)、0.25% 胰酶(貨號(hào)25200-072)均購自Gibco公司；胎牛血清(貨號(hào)S711-001S)、BSA(貨號(hào)U614-002)均購自Lonsera公司；青霉素-鏈霉素溶液(貨號(hào)SV30010)購自Hyclone公司；RIPA裂解液(貨號(hào)78501)購自Thermo公司；BCA試劑盒(貨號(hào)ZJ101)、雙色預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào)WJ102)、PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號(hào)PG113、PG112)、10×電泳緩沖液(貨號(hào)PS105)、10×轉(zhuǎn)膜緩沖液(貨號(hào)PS101)、10×TBS/T(貨號(hào)PS103)、ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)SQ201)均購自上海雅酶生物科技有限公司；Hoechst 33342染色液(貨號(hào)C1022)、JC-1染色試劑盒(貨號(hào)C2006)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào)AS006)、抗體β-actin(貨號(hào)AF0003)購自碧云天公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號(hào)SA00001-1)購自武漢三鷹公司；MTT(貨號(hào)298-93-1)、二甲基亞砜(DMSO，貨號(hào)D8371)、脫脂奶粉(貨號(hào)D8340)、5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)(貨號(hào)P1040)均購自索萊寶公司；抗體Bax(貨號(hào)ab32503)、Bcl-2(貨號(hào)ab182858)、JNK2(貨號(hào)ab32101)、p-JNK2(貨號(hào)ab108596)、STAT3(貨號(hào)ab68153)、p-STAT3(貨號(hào)ab76315)均購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG培養(yǎng)于含1% 100 U/ml青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn) 按照每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度在96孔板中接種U87-MG細(xì)胞，每孔100 μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，用終濃度分別為0 μM、V、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM的AND分別作用12 h、24 h、48 h，其中V組為溶劑對(duì)照組，加入最高藥物濃度組所對(duì)應(yīng)的DMSO。藥物作用到達(dá)相應(yīng)的時(shí)間后，每孔避光加入10 μl MTT(5 mg/ml)，置于37℃ 5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄掉上清液，每孔加入100 μl DMSO搖床15 min，于490 nm處檢測(cè)吸光度值(A值)。U87-MG細(xì)胞生長(zhǎng)率(%)=(加藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。參照文獻(xiàn)[10]，應(yīng)用SPSS 18.0軟件計(jì)算IC50。

1.3.3 JC-1染色實(shí)驗(yàn) 在6孔板中以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)細(xì)胞，加入含AND的培養(yǎng)液，終濃度依次為0 μM、5 μM、10 μM、20 μM，同時(shí)設(shè)定陽性對(duì)照組(含CCCP 10 μM)作用24 h，棄上清，PBS洗1次，每孔加入1 ml 4%多聚甲醇固定20 min；每孔加入2 ml JC-1工作液，37℃孵育20 min；吸除上清液，每孔1 ml JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，最后每孔加入2 ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，于LSM710型激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn) 在6孔板中以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)細(xì)胞制作細(xì)胞爬片。經(jīng)0 μM、5 μM、10 μM、20 μM AND作用24 h后，棄掉原來的培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔加入1 μl Hoechst 33342染色液(5 mg/ml)和1 ml PBS，避光37℃孵育15 min。棄培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，取出細(xì)胞爬片，置于載玻片上，加入抗熒光淬滅劑后，于IX73型熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 收集每組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗2次，加入裂解液，冰上裂解30 min，每10 min渦旋1次。4℃ 12000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量后，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，渦旋后沸水中變性10 min，將蛋白置于-80℃中保存。取30 μg蛋白在SDS-PAGE中分離后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶或5% BSA室溫封閉2 h，TBST洗1次，孵育Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin抗體，放在4℃過夜。TBST洗3次，每次10 min。孵育相應(yīng)的Ⅱ抗。TBST洗3次，每次10 min。在膜上加入ECL化學(xué)發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。用ImageJ軟件進(jìn)行各蛋白條帶的灰度檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)AND對(duì)U87-MG細(xì)胞活力的影響 用3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM濃度的AND分別處理U87-MG細(xì)胞12 h、24 h、48 h后，觀察U87-MG細(xì)胞活力。與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。作用12 h、24 h、48 h AND對(duì)U87-MG細(xì)胞的IC50分別為42.60 μM、13.20 μM、3.68 μM。見圖1。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，***P<0.001。圖1 AND對(duì)U87-MG細(xì)胞活力的影響

2.2 Hoechst 33342染色觀察AND對(duì)U87-MG細(xì)胞凋亡的影響 正常細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對(duì)均勻，核無固縮，故在視野中呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)，而凋亡的細(xì)胞細(xì)胞核呈碎塊狀致密濃染和半月形凝聚。結(jié)果顯示，使用5 μM、10 μM、20 μM的AND處理后細(xì)胞核均出現(xiàn)典型的核固縮染象且發(fā)生凋亡核型改變的細(xì)胞隨藥物濃度的增加而增加。見圖2。

圖2 AND對(duì)U87-MG細(xì)胞凋亡的影響(×100)

2.3 JC-1染色觀察AND對(duì)U87-MG細(xì)胞線粒體膜電位的影響 對(duì)照組的JC-1以多聚體形式存在并呈現(xiàn)紅色熒光，提示線粒體膜電位正常。以線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP作為陽性對(duì)照藥處理U87-MG細(xì)胞24 h后，細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，JC-1以單體形式存在，呈現(xiàn)綠色熒光。AND處理U87-MG細(xì)胞24 h后，隨著AND濃度增大，U87-MG細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度增加，顯示細(xì)胞線粒體膜電位降低。見圖3。

圖3 AND對(duì)U87-MG細(xì)胞線粒體膜電位的影響(×400)

2.4 Western blot 檢測(cè)AND對(duì)U87-MG細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)5 μM、10 μM、20 μM AND處理后，U87-MG細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)隨藥物濃度增加而增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)隨藥物濃度增加而減少。見圖4。

注：與對(duì)照組相比，***P<0.001。圖4 AND對(duì)U87-MG細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白的影響

2.5 Western blot 檢測(cè)AND對(duì)U87-MG細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5 μM、10 μM、20 μM AND下調(diào)U87-MG細(xì)胞內(nèi)JAK2、STAT3和p-STAT3表達(dá)；10 μM、20 μM AND下調(diào)U87-MG細(xì)胞內(nèi)p-JAK2表達(dá)。見圖5。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖5 AND對(duì)U87-MG細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

3 討論

AND是一種常見的天然二萜內(nèi)酯化合物，是從廣西特色中藥爵床科植物穿心蓮中提取的活性成分，具有來源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，因此，AND在抗腫瘤中的作用受到越來越多的關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AND可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，減少細(xì)胞浸潤(rùn)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[9，11-12]。并且作為天然藥物的AND，其脂溶性高，能滲透血腦屏障[13]，對(duì)治療膠質(zhì)瘤有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Yang SL等[14]曾經(jīng)報(bào)道過，AND可以抑制GBM8401和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的標(biāo)準(zhǔn)，可將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ級(jí)至Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ?yàn)榈图?jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤[15]。本研究以Ⅳ級(jí)惡性膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用不同濃度和不同時(shí)間的AND分別作用于細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AND可濃度和時(shí)間依賴性地抑制膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞的生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡是嚴(yán)格受到細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的自主性消亡的過程[16]。細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體正常穩(wěn)定中起著重要作用，機(jī)體可以通過細(xì)胞凋亡來清除損傷、突變和衰老的細(xì)胞，以維持自身的生理平衡。細(xì)胞凋亡伴隨于多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活以及死亡等過程[17-18]。有研究表明[19]，AND可誘導(dǎo)p53蛋白活化增加，進(jìn)而激活下游caspase 7-PARP，誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。我們采用Hoechst染色實(shí)驗(yàn)觀察AND作用后細(xì)胞核型的變化，結(jié)果顯示藥物處理后，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞凋亡數(shù)增加，證明AND誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡。

線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，在凋亡過程中起到樞紐的作用。在凋亡發(fā)生過程中，線粒體膜的通透性會(huì)改變，從而導(dǎo)致線粒體膜電位(MMP)發(fā)生巨大變化[20]。我們采用MMP指示劑JC-1對(duì)藥物處理后的U87-MG細(xì)胞進(jìn)行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MMP的變化情況。JC-1是一種常見的應(yīng)用于檢測(cè)MMP的理想熒光探針。多聚體形式存在的JC-1，呈現(xiàn)紅色熒光，提示MMP正常；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，MMP去極化，JC-1從線粒體內(nèi)被釋放到胞漿內(nèi)，胞漿內(nèi)以單體形式存在的JC-1，發(fā)出綠色熒光。我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用5 μM AND處理之后，U87-MG細(xì)胞MMP降低，濃度為20 μM時(shí)，對(duì)MMP的影響幾乎接近10 μM CCCP，表明AND能通過降低MMP誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡；在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究AND對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的調(diào)控作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，它們?cè)谡{(diào)控細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要的作用[21]。Western blot結(jié)果顯示，U87-MG細(xì)胞經(jīng)AND處理24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)且促凋亡蛋白Bax上調(diào)，為進(jìn)一步研究AND抗膠質(zhì)瘤的詳細(xì)機(jī)制提供了重要依據(jù)。

JAK2/STAT3信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡有關(guān)[22-24]。JAK是一類非跨膜型的酪氨酸激酶[25]。當(dāng)配體和受體結(jié)合后JAK被活化，使其發(fā)生自身磷酸化，活化的JAK可以作為激酶，磷酸化下游靶蛋白的酪氨酸殘基，進(jìn)行信號(hào)傳遞。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子STAT被招募，并且被活化的JAK磷酸化修飾后，就形成了活化的狀態(tài)，活化的STAT蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與相關(guān)靶基因結(jié)合，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[26]。有研究表明，AND在多種癌細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和凋亡[13，27]。Zhou J等[28]發(fā)現(xiàn)AND在HCT116細(xì)胞中有效抑制IL-6引起STAT3的磷酸化并在mRNA水平下調(diào)p-JAK1和p-JAK2，從而增加HCT116細(xì)胞對(duì)阿霉素化療的敏感性。目前，已有多個(gè)研究表明，在膠質(zhì)瘤治療過程中抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[29-30]。本實(shí)驗(yàn)中，AND下調(diào)JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平，表明AND在膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞中抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)控U87-MG細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究顯示，AND對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用，且與JAK2/STAT3信號(hào)通路的失活相關(guān)。本研究為膠質(zhì)瘤的治療提供了初步的理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為民族醫(yī)藥應(yīng)用于臨床治療膠質(zhì)瘤提供新策略。