黃永毅，李如佳，黃干榮，覃艷春，李曉華，黃衍強(qiáng)，羅顯克

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院耐藥微生物感染防治研究中心，廣西 百色 533000；2. 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530001)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp) 是牙周炎、胃炎、消化性潰瘍和胃癌等多種疾病的重要病因[1]。Hp感染人數(shù)超過全球約50%以上的人口[2]，目前主要采用抗生素進(jìn)行治療，但隨著抗生素的廣泛使用和濫用，Hp耐藥率逐年遞增，急需新的藥物用于治療[3]。從天然產(chǎn)物如植物、中藥中篩選活性成分是研發(fā)新型藥物比較快速、有效的方法[4]。我國(guó)一些傳統(tǒng)中藥具有良好的抑菌效果，不易產(chǎn)生耐藥，且安全性高，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[5]。澤蘭(Eupatorium japonicum Thunb.)是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有清熱解毒，祛瘀消癰等功效，澤蘭中的一些萜類、苯并呋喃類[6]、黃酮類成分，具有明顯的抑菌效果[7]。從澤蘭中篩選出抗菌效果良好、成藥性高的先導(dǎo)物頗具研究前景，但目前有關(guān)澤蘭中抗Hp及其有效成分的研究尚未見報(bào)道。為此，本文主要以Hp為供試菌，篩選澤蘭中抗Hp的有效成分，以期為澤蘭有效成分作為先導(dǎo)化合物的研發(fā)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥澤蘭購(gòu)自中藥材誠(chéng)實(shí)通平臺(tái)、澤蘭黃酮(CAS號(hào)：520-11-6)、半齒澤蘭素(CAS號(hào)：855-96-9)、異澤蘭黃素(CAS號(hào)：22368-21-4)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，BactoTM Brain Heart infusion(BHI)培養(yǎng)基、哥倫Columbia blood Agar base(G)培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)小牛血清、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自南京晶格化學(xué)科技有限公司，Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株由南京醫(yī)科大學(xué)畢洪凱實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，Hp臨床分離菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離獲得。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂稀釋法檢測(cè)澤蘭水提物最小抑菌濃度(MIC90) ①水提物制備：中藥澤蘭準(zhǔn)確稱量重量。加水沒過澤蘭浸泡30 min，煎煮3次，第1次煮1 h，第2次煮45 min，第3次煮30 min。其間不斷加水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，使用玻璃棒攪拌，避免糊底，每次煎煮完成后，過濾，得濾液，再加適量水重新煎煮。合并3次濾液，濃縮，真空干燥，干燥完成后放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。②瓊脂板制備：將不同濃度的抗菌藥物分別加入50 ml燒瓶，使培養(yǎng)基和藥物混合后含藥量分別是100 mg/ml、10 mg/ml、1 mg/ml、0.1mg/ml，藥物和培養(yǎng)基總量為20 ml。③菌液制備及接種：取固體平板上對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基制作成菌懸液，Hp調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，備用；其余細(xì)菌調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，稀釋10倍，備用；真菌調(diào)整菌液濃度為5×106CFU/ml(OD600為0.5)，稀釋100倍，備用。取1 μl接種于瓊脂表面，每點(diǎn)菌數(shù)約為Hp為105CFU/ml，其余細(xì)菌為104CFU/ml，真菌為5×102CFU/ml。并取1 μl菌液接種于菌株原培養(yǎng)基作陽(yáng)性對(duì)照，含藥液的瓊脂板作陰性對(duì)照。接種好放置相應(yīng)培養(yǎng)箱孵育。④判斷結(jié)果：當(dāng)含藥物未加菌的陰性對(duì)照板上細(xì)菌無生長(zhǎng)和菌株原培養(yǎng)基陽(yáng)性板上有菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義。將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。在孔瓊脂表面上可見輕微細(xì)菌生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)對(duì)照比較抑制80%以上細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為終點(diǎn)濃度。如果出現(xiàn)有2個(gè)以上菌落生長(zhǎng)于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.2 微量稀釋法檢測(cè)有效成分最小抑菌濃度(MIC90) ①抗菌藥物制備：抗菌藥物貯存液濃度4000 μg/ml。②96孔板制備：第1孔先加培養(yǎng)基173.6 μl，其它各孔加培養(yǎng)基90 μl，第1孔再加6.4 μl抗菌藥物，按倍稀釋至第11孔；第12孔作為加菌不加藥對(duì)照，保留90 μl培養(yǎng)基。③菌液制備：取固體平板上對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基制作成菌懸液，Hp調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，稀釋10倍，備用；其余細(xì)菌調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，稀釋100倍，備用；真菌調(diào)整菌液濃度為5×106CFU/ml(OD600為0.5)，稀釋1000倍，備用。④接種菌液：取上述備用菌液10 μl加至第1～10孔和第12孔(Hp工作濃度為1×106CFU/ml，其余細(xì)菌工作濃度為1×105CFU/ml，真菌工作濃度為5×102CFU/ml)，第11孔作為不加菌對(duì)照，只加無菌水。培養(yǎng)72 h判斷結(jié)果。1～10孔藥物濃度分別為128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。⑤判斷結(jié)果：當(dāng)不含菌的陰性對(duì)照孔(即第11孔)內(nèi)細(xì)菌無生長(zhǎng)和有菌無藥物陽(yáng)性孔 (第12孔)有菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義。以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為MIC。如果出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度，如果出現(xiàn)多處跳孔，則該次結(jié)果作廢，結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.3 瓊脂稀釋法檢測(cè)有效成分最小抑菌濃度(MIC90) ①瓊脂板制備：將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入50 ml燒瓶，對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基在50～55℃恒溫器中保持液態(tài)，按比例加入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基和藥物混合后含藥量分別是128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml，藥物和培養(yǎng)基總量為10 ml。②菌液制備及接種，同1.2.1。③判斷結(jié)果，同1.2.1。

2 結(jié)果

2.1 澤蘭水提物抑菌效果 用瓊脂稀釋法檢測(cè)澤蘭水提物最小抑菌濃度，如表1所示。發(fā)現(xiàn)澤蘭水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌抑菌效果良好，MIC為1 mg/ml。對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌也有抑制效果，MIC為10 mg/ml。

表1 澤蘭水提物抑菌效果

2.2 澤蘭有效成分篩選結(jié)果 購(gòu)買的3種澤蘭中主要抑菌成分對(duì)兩種Hp供試菌的MIC值，如表2所示。由表中MIC可知，異澤蘭黃素、澤蘭黃酮對(duì)Hp敏感或耐藥菌株均有很好的抑制效果，MIC值為16 μg/ml。半齒澤蘭素對(duì)Hp菌株未見明顯抑菌效果，MIC>128 μg/ml。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)為有效成分抑菌濃度是否小于水提物抑菌濃度。

表2 澤蘭中主要成分對(duì)Hp的MIC檢測(cè) 單位：μg/ml

2.3 澤蘭成分對(duì)18種Hp菌株MIC檢測(cè)結(jié)果 異澤蘭黃素、澤蘭黃酮對(duì)18種Hp供試菌藥敏MIC檢測(cè)結(jié)果，如表3所示。瓊脂稀釋法驗(yàn)證MIC檢測(cè)結(jié)果，如圖1所示，異澤蘭黃素和澤蘭黃酮對(duì)敏感、耐藥和多重耐藥Hp菌株均有良好的抑菌效果，MIC值16～64 μg/ml。

3 討論

隨著抗生素的廣泛使用和濫用，使得Hp耐藥性逐年遞增，且抗生素的不良反應(yīng)越來越突出。因此，探索新型藥物用于治療是非常急迫的任務(wù)。本研究發(fā)現(xiàn)，澤蘭水提物對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠球菌等菌株具有不同程度的抑制作用，對(duì)Hp抑制效果更為明顯。池水晶等[8]采用不同試劑粗提澤蘭，發(fā)現(xiàn)澤蘭的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌等具有明顯的抑制效果。陳芝蕓等[9]篩選100種中藥發(fā)現(xiàn)澤蘭對(duì)Hp具有很好的抑制效果。這些與我們的研究結(jié)果是一致的，但目前澤蘭中具體抑制Hp的有效成分尚未見報(bào)道。

表3 澤蘭成分對(duì)18種Hp菌株MIC檢測(cè) 單位：μg/ml

注：3個(gè)培養(yǎng)基從左至右藥物濃度分別為64 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml。圖1 不同濃度藥物對(duì)Hp菌株抑制作用檢測(cè)

本文為深入研究澤蘭的抑菌效果，購(gòu)買了3種澤蘭中的有效成分，篩選出了澤蘭中主要抑制Hp的有效成分異澤蘭黃素和澤蘭黃酮。異澤蘭黃素和澤蘭黃酮對(duì)敏感和耐藥的Hp菌株均有較好的抑制效果，MIC值16～64 μg/ml，優(yōu)于水提物的抑菌效果?，F(xiàn)代研究表明，異澤蘭黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[10]，對(duì)一些酶也存在強(qiáng)烈的抑制作用[11]，但對(duì)其抑菌活性研究甚少。張菲等[12]發(fā)現(xiàn)包含澤蘭黃酮成分的谷精草乙醇提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，但未見抑制Hp的相關(guān)報(bào)道。本研究盡管篩選出了澤蘭中主要抑制Hp的有效成分，但目前還僅限于體外實(shí)驗(yàn)，如果能進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并掌握其抗菌機(jī)制，進(jìn)一步提高其藥效和安全性，那么將是非常理想的新型抗Hp先導(dǎo)化合物。

綜上所述，澤蘭水提物對(duì)Hp具有較好的抑制效果，澤蘭中的異澤蘭黃素和澤蘭黃酮對(duì)敏感和耐藥的Hp菌株均有較好的抑制效果，是澤蘭的主要抗菌成分。