艾錦新，龍安炬，羅衛(wèi)星，蔡惠芬*

(1. 貴州大學動物科學學院/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

心臟型脂肪酸結合蛋白(heart fatty acid binding protein, H-FABP)是脂肪酸結合蛋白(FABP)家族中重要的一員，又名FABP3，是一種低分子量胞漿蛋白，主要在心肌、骨骼肌和脂肪細胞中表達[1-3]。FABP3基因主要通過參與胞內長鏈脂肪酸的攝取、轉運和利用，調節(jié)脂肪代謝；在脂肪生成過程中，FABP3基因通過在心肌和脂肪細胞中沉積甘油三酯，從而促進肌內脂肪(intramuscular fat, IMF)沉積，增加IMF含量[4-5]。山羊的FABP3基因定位于2號染色體上，由5個外顯子和4個內含子組成[6]。在基因多態(tài)性上，余剛等[7]研究發(fā)現，FABP3基因第2外顯子的SNP與陜北絨山羊的生長性狀(胸圍、管圍)、胴體性狀(眼肌面積、背膘厚度)顯著相關。羅燕等[8]研究發(fā)現，FABP3基因外顯子2存在多態(tài)位點且具有3種基因型AA、AB和BB，其中BB基因型是影響中國美利奴羊IMF的優(yōu)勢基因型。曲亮等[9]研究發(fā)現，FABP3基因多態(tài)性與蘇淮豬的胴體性狀極顯著相關。王珊等[10]研究發(fā)現，FABP3基因HaeⅢ位點存在多態(tài)性，各基因型秦川牛及其雜種牛的體質量、胸圍存在顯著差異。在基因表達水平上，Huang等[11]研究發(fā)現，30～90日齡的公哈薩克綿羊肌肉組織FABP3基因的mRNA表達水平與肌間脂肪含量呈極顯著的強正相關。岳彩娟等[12]研究發(fā)現，FABP3基因的表達量與灘羊背最長肌、股二頭肌及腰大肌的IMF均呈正相關。沙爾山別克·阿不地力大等[13]研究發(fā)現，不同發(fā)育階段拜城油雞的肌肉組織中FABP3基因mRNA表達量與其IMF含量呈一定的相關性。這些研究結果表明，FABP3基因可能是影響動物生長發(fā)育的重要基因。

黔北麻羊是貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一，其具有適應性強、耐粗飼、膻味輕、肉質鮮美、皮張品質好、生產性能優(yōu)等特點，深受廣大消費者和養(yǎng)殖戶的青睞[14-15]。本研究以黔北麻羊為研究對象，對影響山羊肌肉發(fā)育和肉質相關性狀的FABP3基因進行研究，在FABP3基因中檢測影響黔北麻羊重要經濟表型的基因突變，尋找與生長發(fā)育性狀具有關聯性的遺傳標記，為后續(xù)的分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機選取貴州省習水縣富興牧業(yè)有限公司飼養(yǎng)管理條件相同、健康無病的6月齡黔北麻羊120只(公羊67只、母羊53只)，頸靜脈釆血8 mL，用肝素鈉抗凝，置于冰盒帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

血液基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；核酸染料、DL2000 Maker、2×EsTaqMasterMix均購自北京康為世紀生物科技有限公司；雙蒸水、TAE緩沖液、瓊脂糖凝膠均為實驗室自備。

1.3 主要儀器

梯度PCR儀(Bio-rad公司)；高速離心機(無錫瑞江分析儀器有限公司)；超微量分光光度計(NANODROP 2000，Thermo公司)；電泳槽和電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)；凝膠成像成像儀(Bio-rad公司)。

1.4 基因組DNA提取

試驗采用血液基因組DNA提取試劑盒，分別對120頭黔北麻羊血液中的基因組DNA進行抽提，并用超微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，取檢測結果完好的DNA樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設計及PCR擴增測序

根據GenBank發(fā)布山羊FABP3基因序列(NC_030809.1)，利用Primer5.0引物設計軟件設計5對特異性引物用于該基因全部外顯子的擴增，引物詳細信息見表1。PCR擴增反應體系為30 μL：2×EsTaqMasterMix 13 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各2 μL，雙蒸水10 μL；反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察電泳結果，鑒定正確的PCR產物送往上海生物工程有限公司進行測序。

表1 引物信息

1.6 生長性狀指標測定

按照文獻[16-17]測定各試驗羊的生長性狀指標(包括體重、體高、體斜長、胸圍、胸深、胸寬和管圍)，并做好數據記錄。

1.7 SNP篩查與數據統計分析

測序結果用DNAStar軟件進行序列分析和峰圖比對，篩選出SNP位點；然后利用Microsoft Excel 2010軟件統計各基因型在黔北麻羊群體中的分布情況，計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)及卡方值(χ2)。采用SPSS 18.0統計軟件一般線性模型(GLM)對各基因型與生長性狀指標進行差異顯著性檢驗，以P<0.05為差異顯著水平，結果均以“最小二乘均值±標準誤”表示。一般線性模型如下：

Yij=μ+&ij+bij+&ij×bij+eij，

式中，Yij表示性狀表型值，μ表示總體均值，&ij表示基因型效應，bij表示品種效應，eij為隨機差。

2 結果與分析

2.1 FABP3基因PCR擴增

以黔北麻羊FABP3基因組DNA為模板，分別擴增FABP3基因全部外顯子區(qū)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1。由圖1可知，擴增產物與目的片段大小一致，條帶清晰明亮，無非特異性擴增，無明顯拖尾現象，說明引物特異性良好，PCR產物可直接用于測序。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.引物分別為P1、P2、P3、P4、P5，每對引物2個重復圖1 黔北麻羊FABP3基因產物電泳

2.2 PCR產物測序及序列分析

PCR產物進行直接測序，測序結果經序列比對分析，在黔北麻羊FABP3基因第5外顯子區(qū)域篩選出1個SNP位點(C/T)，命名為g.13665051C>T，該突變未引起編碼氨基酸發(fā)生改變，屬同義突變，產生3種基因型：CC、CT和TT；同時在黔北麻羊FABP3基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)也篩選出1個SNP位點(G/A)，命名為g.13664737G>A，該突變產生3種基因型：GG、AG和AA，測序峰如圖2所示。

圖2 黔北麻羊FABP3基因單個樣本測序峰

2.3 FABP3基因遺傳學分析

對黔北麻羊FABP3基因2個SNPs位點進行群體遺傳特性分析，結果見表2。由表2可知，黔北麻羊FABP3基因g.13665051C>T位點中CC為優(yōu)勢基因型，等位基因C為優(yōu)勢等位基因，該基因座基因純合度為0.562，雜合度為0.438，有效等位基因為1.779，多態(tài)信息含量為0.341，屬中度多態(tài)位點；黔北麻羊FABP3基因g.13664737G>A位點中GG為優(yōu)勢基因型，等位基因G為優(yōu)勢等位基因，該基因座基因純合度為0.531，雜合度為0.469，有效等位基因為1.883，多態(tài)信息含量為0.359，屬中度多態(tài)位點?？ǚ?χ2)檢驗結果顯示，g.13665051C>T和g.13664737G>A突變位點的基因型分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 SNPs位點在黔北麻羊中的群體遺傳信息

2.4 FABP3基因不同基因型與生長性狀的關聯分析

對黔北麻羊FABP3基因SNPs位點與生長性狀進行關聯分析，結果見表3。由表3可知，在黔北麻羊群體中，FABP3基因g.13665051C>T位點中CC、CT和TT基因型個體間的體重差異不顯著(P>0.05)，CT基因型個體的體高、體斜長、胸寬和管圍顯著高于CC和TT基因型個體(P<0.05)，CC和CT基因型個體的胸圍、胸深顯著高于TT基因型個體(P<0.05)，其中雖然CC和CT基因型個體的胸圍、胸深無顯著差異(P>0.05)，但是CT基因型個體的胸圍、胸深高于CC基因型個體；在FABP3基因g.13664737G>A位點中GG、AG和AA不同基因型的生長性狀指標均差異不顯著(P>0.05)。

表3 黔北麻羊FABP3基因SNPs位點與生長性狀的關聯性分析

3 討論

FABP3基因具有特異結合脂肪酸及調節(jié)脂肪酸代謝的重要功能，對畜禽的肉質性狀、生長性狀兼有影響[18]。本研究通過PCR產物直接測序技術對黔北麻羊FABP3基因的SNP進行檢測，篩選出2個SNPs位點g.13665051C>T和g.13664737G>A,其中g.13665051C>T位于外顯子5，產生3種基因型：CC、CT和TT；g.13664737G>A位于3′非翻譯區(qū)，產生3種基因型：GG、AG和AA。其中g.13665051C>T突變是位于編碼區(qū)的同義突變，編碼區(qū)的同義突變雖不改變編碼的氨基酸，但可能引起外顯子拼接增強，從而影響蛋白質的表達量[19-20]。有研究表明，同義突變可以通過改變mRNA的二級結構[21]或改變核糖體通過mRNA特定區(qū)域時的速度[22]來改變蛋白質的結構和功能。因此，g.13665051C>T突變仍可能是會改變蛋白質空間結構，進而影響蛋白質正常功能的重要突變。

多態(tài)信息含量、雜合度與群體遺傳多樣性密切相關，其值的高低反映了群體內個體的均質度，群體遺傳變異程度越大，說明該群體的遺傳多樣性就越豐富，選擇潛力就越大，對育種改良就越有利[1]。本研究從純合度、雜合度、有效等位基因數、多態(tài)信息含量等指標多角度對黔北麻羊群體的遺傳變異程度進行分析，發(fā)現g.13665051C>T位點基因座的純合度為0.562，雜合度為0.438，有效等位基因為1.779，多態(tài)信息含量為0.341，為中度多態(tài)位點；g.13664737G>A位點基因座的純合度為0.531，雜合度為0.469，有效等位基因為1.883，多態(tài)信息含量為0.359，為中度多態(tài)位點，說明2個SNPs位點的群體遺傳變異程度較大，遺傳多樣性較為豐富，具有一定的選擇潛力?？ǚ?χ2)檢驗結果顯示，黔北麻羊群體FABP3基因的基因型分布并未受到遺傳漂變及人工選育的影響[23]，符合Hardy-Weinberg平衡。

近年來，隨著分子生物技術的發(fā)展，生長性狀相關的分子標記已廣泛應用于畜禽的育種改良中，大大提高了育種效率，縮短了育種進程[24]。本研究除在黔北麻羊FABP3基因外顯子5和3′非翻譯區(qū)各發(fā)現1個SNP位點外，并未發(fā)現其他突變位點，這與黃李勇等[1]在新疆巴什拜羊FABP3基因外顯子2發(fā)現1個SNP位點和趙雪[25]在東北半細毛羊、小尾寒羊、杜泊和道賽特羊4個群體中發(fā)現FABP3基因外顯子2存在4個突變位點，外顯子3存在3個突變位點的結果存在差異，可能是由于品種、遺傳基礎和樣本數量不同所致。本研究采集了黔北麻羊的體重、體高、體斜長、胸深、胸寬、胸圍及管圍等生長性狀數據，并與在FABP3基因上篩選出的2個SNPs位點進行關聯分析，結果顯示，g.13665051C>T突變位點除了對黔北麻羊體重無顯著影響外，對其體高、體斜長、胸圍、胸深、胸寬和管圍均有顯著影響；但g.13664737G>A突變位點對黔北麻羊體重、體高、體斜長、胸圍、胸深、胸寬和管圍均無顯著影響。由此推測，g.13665051C>T突變位點在對黔北麻羊生長性狀指標上的影響程度大于g.13664737G>A突變位點。余剛等[26]研究發(fā)現周歲陜北絨山羊FABP3基因內含子3存在SNP位點，產生2種基因型：AA和AB，其AB基因型的體高、胸圍顯著高于AA基因型；曾鴻普等[27]研究發(fā)現五指山豬FABP3基因外顯子2存在多態(tài)性，產生3種基因型：AA、AB和BB,其8月齡AB基因型五指山豬的體質量、體長和10月齡AB基因型五指山豬的胸圍顯著高于AA、AB基因型。上述研究結果與本試驗在g.13665051C>T位點上的研究結果存在一定的相似性，證實了FABP3基因上的SNP位點與部分生長性狀存在關聯性，且會對部分生長性狀產生影響。而柴志欣等[4]研究發(fā)現麥洼牦牛FABP3基因外顯子4存在T7339C突變，但該突變對麥洼牦牛的生長性狀均無顯著影響，這與本試驗g.13664737G>A位點的關聯性分析結果一致。綜合分析2種不同結果，可能是由于檢測的位點、品種、采集生長性狀數據的階段及統計分析方法不同引起。在本次關聯性分析中，g.13665051C>T位點中CT基因型的體高、體斜長、胸寬和管圍均顯著高于CC、TT基因型，CT基因型的胸深、胸圍顯著高于TT基因型，這表明g.13665051C>T突變位點顯著影響黔北麻羊的諸多生長性狀指標，初步推測FABP3基因外顯子5的g.13665051C>T突變有可能作為一種遺傳標記，通過對優(yōu)勢基因型的選擇，從而加快對黔北麻羊的育種改良。

4 結論

本研究在黔北麻羊FABP3基因外顯子5和3′非翻譯區(qū)各檢測出1個SNP位點，分別為g.13665051C>T、g.13664737G>A。其中g.13665051C>T為同義突變，產生3種基因型：CC、CT和TT；g.13664737G>A產生3種基因型：GG、AG和AA。通過遺傳學分析，黔北麻羊FABP3基因存在較為豐富的遺傳多態(tài)性。經關聯性分析顯示，g.13665051C>T突變位點對黔北麻羊體高、體斜長、胸圍、胸深、胸寬和管圍均有顯著影響，可作為一種遺傳標記用于輔助性選擇。