戎杰，孔令明，陳喬光，侯照峰，劉丹丹，陶建平，許金俊*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

組織滴蟲病又稱黑頭病或盲腸肝炎，是由火雞組織滴蟲(Histomonasmeleagridis)引起的一種禽類原蟲病，以盲腸腫大、肝臟嚴(yán)重壞死以及排硫磺樣糞便為主要臨床特征[1-2]。多年以來，化學(xué)藥物一直是防治組織滴蟲病的主要手段，發(fā)揮了巨大的作用。由于對人體潛在的毒性和致癌性，歐盟已完全禁用所有對組織滴蟲病具有療效的化學(xué)藥物，美國也已禁止使用除硝基苯胂酸以外的其他化學(xué)藥物[3]，我國農(nóng)業(yè)部第193號公告中也將硝基咪唑類藥物列入《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》[4],因而導(dǎo)致該病在雞群和火雞群中大量暴發(fā)和流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。盡管部分天然植物提取物已被證實(shí)對蟲體的體外繁殖具有一定的抑制作用，但對自然或人工感染的組織滴蟲病療效甚微[7]，因此，針對該病的安全可靠的新藥或疫苗的研制顯得尤為迫切。

火雞組織滴蟲人工感染后在禽類體內(nèi)的分布規(guī)律有少量報(bào)道[8]，而自然感染雞組織臟器中蟲體的分布規(guī)律還不太清楚。本研究通過對2018年4至5月期間揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院21例臨床疑似組織滴蟲病的病雞體內(nèi)321個臟器組織中蟲體DNA 的PCR檢測，揭示臨床自然感染雞組織臟器中蟲體的分布規(guī)律，為闡明火雞組織滴蟲的致病機(jī)理和傳播途徑，以及藥物和疫苗的效果評價(jià)提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床病料

病料來自于2018年4至5月期間揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院接診的組織滴蟲病臨床疑似病例21例，這些病雞來自于江蘇省揚(yáng)州市及周邊地區(qū)，有散養(yǎng)草雞、商品蛋雞、三黃雞等多個品種，年齡通常在1至2月齡。所采取的組織臟器有：肝臟、胰腺、膽囊、食道、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、氣管、肺臟、心臟、腎臟、腦、脾臟、法氏囊和盲腸扁桃體共19種組織器官，共有321份組織器官樣品。

1.2 主要試劑

DL2000 Marker、MiniBEST通用基因組DNA提取試劑盒Ver.5.0購自TaKaRa公司；1 kb DNA Ladder、10×PCR Buffer、dNTP mix、TaqDNA聚合酶購自上海生工生物工程有限公司；含火雞組織滴蟲 18S rRNA 基因的陽性質(zhì)粒 pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣品DNA的提取

按照TaKaRa公司的DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，用NanoDrop2000測定純度和濃度后-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 臟器中火雞組織滴蟲蟲體DNA的PCR檢測

按照參考文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)擴(kuò)增火雞組織滴蟲18S rRNA基因片段的引物，預(yù)期擴(kuò)增片段576 bp,引物由北京六合華大基因公司合成，序列如下：F1:5′-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3′；F2:5′-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：ddH2O 18.25 μL，10× PCR Buffer 2.50 μL，10 mol/L dNTP mix 2.00 μL，10 μmol/L F1 0.50 μL，10 μmol/L F2 0.50 μL，50 ng/μLTaqDNA聚合酶0.25 μL，DNA模板1.00 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性35 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1.2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，EB染色15 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。每次PCR檢測時(shí)設(shè)立pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA 為模板的陽性對照和以滅菌水為模板的陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 病雞臨床表現(xiàn)和剖檢變化

病雞臨床表現(xiàn)為：精神沉郁、縮頭垂翅、被毛蓬亂而無光澤、呆立或聚堆，排黃綠色稀糞，糞便中甚至有時(shí)帶有組織碎片和血液。病雞解剖可見：肝臟腫大，表面存在稍凹陷的圓形潰瘍灶，數(shù)量和大小不等，有時(shí)會相互融合形成大面積潰瘍區(qū)(圖1A)，少數(shù)病雞肝臟上黃白色的壞死點(diǎn)散在分布(圖1B)；盲腸則顯著腫大，盲腸壁增厚明顯，內(nèi)有栓塞物，黏膜呈現(xiàn)出血、壞死和潰瘍(圖1C)；其他組織臟器病變不明顯。

A：典型肝臟病變；B：非典型肝臟病變；C：典型盲腸病變圖1 疑似組織滴蟲病病雞的肝臟與盲腸

2.2 PCR檢測

將臨床病料組織樣品提取DNA后進(jìn)行PCR檢測，部分臟器的PCR檢測凝膠電泳結(jié)果見圖2，其中陽性對照在576 bp處有條帶，樣品中呈陽性的在576 bp 處也出現(xiàn)條帶，而陰性對照無條帶。所有樣品的PCR檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可見，不同臟器蟲體檢出率不同，其中肝臟和盲腸檢出率最高，分別為57.1%和52.4%；回腸、脾臟、腎臟、肌胃、胰腺和腦的檢出率依次為43.8%、40.0%、40.0%、37.5%、35.7%、33.3%；心肺及其他腸道組織甚至法氏囊等檢出率都較低，低于30%；膽囊的檢出率為0。

表2 321份組織樣品PCR檢測結(jié)果

M. DL2000 Marker; 1.陽性對照；2.陰性對照；3.肝；4.脾；5.肺；6.腎；7.腦；8.回腸；9.肌胃；10.腺胃；11.胰腺；12.十二指腸；13.氣管；14.食道；15.法氏囊；16.盲腸；17.直腸；18.盲腸扁桃體；19.膽囊圖2 部分疑似病雞組織器官的蟲體DNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

關(guān)于火雞組織滴蟲在人工感染雞火雞體內(nèi)的檢測與分布規(guī)律，國內(nèi)外有過一些研究和報(bào)道。禚振男[10]使用實(shí)驗(yàn)室分離純培養(yǎng)的火雞組織滴蟲單克隆蟲株 JSYZ-A 株經(jīng)泄殖腔感染 15日齡蘇禽黃羽肉雞，并在感染后不同時(shí)間采取12個臟器樣本進(jìn)行 PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盲腸與肝臟分別在第13天和 第 16天時(shí)檢出率最高達(dá)到 100%，隨后降低；從第10天開始可以發(fā)現(xiàn)在十二指腸、空腸、直腸和脾臟中能檢測到火雞組織滴蟲；至感染第13天后可檢測到腺胃和心臟均有火雞組織滴蟲存在；在感染第19天后的肺臟中才能檢測到蟲體。說明火雞組織滴蟲主要寄生于盲腸和肝臟，在十二指腸、空腸、直腸、脾臟、腺胃及心臟等也會出現(xiàn)蟲體感染。而Singh等[11]運(yùn)用多克隆抗體免疫組化技術(shù)，成功地在試驗(yàn)感染火雞的多個器官中定位了火雞組織滴蟲抗原，發(fā)現(xiàn)盲腸、肝臟、肺、脾檢出率為 100%，法氏囊檢出率為60%，心臟、小腦、前胃、胰腺等檢出率較低。孔令明等[12]將 JSYZ-A 株蟲體通過泄殖腔感染15日齡蘇禽黃羽肉雞，在感染后1～34 d內(nèi)，每3 d撲殺5只感染雞，采集其不同組織臟器樣品，并對樣品進(jìn)行PCR檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明肝臟、盲腸、十二指腸、空-回腸、直腸、腺胃和法氏囊均檢測到火雞組織滴蟲，肝臟、盲腸存在時(shí)間最長，同時(shí)脾、肺和腦等組織也檢測到了火雞組織滴蟲，在腎臟和胰臟中并未發(fā)現(xiàn)火雞組織滴蟲。Lotfi等[13]通過人工感染試驗(yàn)也觀察到雞肝臟與盲腸以外器官的病理變化，并在肺和脾等組織中檢測到組織滴蟲的存在。本次自然感染雞臟器分布結(jié)果與人工感染獲得的結(jié)果基本一致，同時(shí)臟器分布上也存在一定微小差異，這些差異與人工感染蟲株的毒力、試驗(yàn)動物的種類、觀察的時(shí)間點(diǎn)等因素相關(guān)。

與人工感染試驗(yàn)后的臟器檢出率較高相比而言，臨床疑似病料中蟲體DNA的檢出率不高，究其原因，存在多方面的可能[14-15]。首先，腸道和糞便中含有一些TaqDNA聚合酶的抑制劑，會造成某些樣品的假陰性結(jié)果，PCR方法對盲腸樣品的檢出率為52.4%，低于肝臟樣品的57.1%，也證實(shí)了這種可能性的存在；其次，Bilic 等[16]也指出根據(jù)18S rRNA序列分析，各基因型間存在一定的遺傳多樣性，而同一基因型內(nèi)的遺傳異質(zhì)性也存在差異，這可能也是檢出率稍低的原因；此外，一些未知物種或與其他原生生物(如毛滴蟲或四毛滴蟲)的混合感染被認(rèn)為是引起組織滴蟲病的原因或引起與組織滴蟲病類似的癥狀和病變，這也是臨床樣品中檢出率不高的原因之一[17]。

綜上，本研究系統(tǒng)地闡述了臨床病雞中火雞組織滴蟲體內(nèi)的分布規(guī)律，進(jìn)一步明確了其靶器官為盲腸和肝臟。除靶器官肝臟與盲腸外，也可通過檢測回腸、脾臟和腎臟等檢出率較高的組織臟器來確認(rèn)是否感染，為組織滴蟲病的臨床診治提供一定的參考，也為以后探究其致病機(jī)理和疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。