李立新， 蒲競， 蔡翠芳， 李文詳

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第五位，死亡率居第三位，給人們的健康帶來嚴(yán)重威脅[1]。據(jù)報(bào)道，全世界范圍內(nèi)，患者在胃癌早期階段被成功診斷的不到五分之一[2]。在包括中國在內(nèi)的一些東亞國家，胃癌發(fā)病率明顯高于其他國家[3]。迄今為止，手術(shù)和放、化療是胃癌的主要治療手段，但仍達(dá)不到理想的治療效果[4]。因此，探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，對于開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。鈣黏蛋白超家族(cadherin)是細(xì)胞表面糖蛋白，主要調(diào)節(jié)Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，影響細(xì)胞極性、形態(tài)發(fā)生以及細(xì)胞識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。T-鈣黏蛋白(T-cadherin,T-cad)是鈣黏蛋白超家族成員之一，其缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，通過糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI)結(jié)合細(xì)胞膜[6]。T-cadherin在多種癌癥中顯著下調(diào)，提示其可能作為抗癌蛋白參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[7]。已有研究證明，上調(diào)T-cadherin可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]。鋅指蛋白545和青藤堿通過抑制Wnt/β-catenin、PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路活化在大腸癌和胃癌中起抑癌作用[9-10]。目前，還未有關(guān)于T-cadherin通過Wnt/ERK/PI3K-AKT信號通路對胃癌細(xì)胞作用的研究。本研究旨在探究T-cadherin通過Wnt/ERK/PI3K-AKT信號通路對胃癌細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期阻滯和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，以期為探討胃癌發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司；T-cadherin和陰性對照(NC)慢病毒液購自武漢金開瑞生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8購自日本同仁研究所；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和DNA含量檢測試劑盒(細(xì)胞周期)購自北京索萊寶科技有限公司；T-cadherin、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、Wnt、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；cleaved caspase 3、p-ERK和PI3K抗體購自美國Abcam公司；Beclin1、輕鏈3(LC3)、p-AKT和AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染 AGS和GES-1細(xì)胞均用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將對數(shù)期生長的AGS細(xì)胞按1×105個(gè)/孔數(shù)量加入6孔板內(nèi)，24 h后，將每孔內(nèi)培養(yǎng)基更換為含5 μg/ml聚凝胺和2%FBS的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為3組：空白組、NC組和T-cad組，向孔內(nèi)添加25 MOI的NC和T-cad慢病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外將細(xì)胞分為NC組、HCQ組、T-cad組和T-cad+HCQ組，向孔內(nèi)添加25 MOI的NC、T-cad慢病毒液和羥氯喹(HCQ，自噬抑制劑)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中，HCQ終濃度為30 μmol/L。

1.3 CCK-8檢測胃癌細(xì)胞活力 將對數(shù)期生長的AGS細(xì)胞接種于96孔板(5×103個(gè)/孔)，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)0、24、48和72 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃、5%CO2條件下孵育3 h。酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞的增殖能力 取200個(gè)對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2周。無水乙醇固定細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色10 min，流水洗去染液，空氣干燥。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞周期變化和凋亡 細(xì)胞周期檢測：收集慢病毒感染后的AGS細(xì)胞，70%預(yù)冷乙醇固定，PBS清洗后，RNase A溶液重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min。加入PI染色液，4 ℃避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞凋亡檢測：收集慢病毒感染后的AGS細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞后，Binding Buffer重懸細(xì)胞，隨后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，加入PI室溫避光孵育5 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 Western blotting檢測胃癌細(xì)胞T-cadherin、自噬和Wnt/ERK/PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集慢病毒感染后的AGS細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入T-cadherin(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、cleaved caspase 3(1∶1 000)、Wnt(1∶1 000)、β-catenin(1∶2 000)、p-ERK(1∶1 000)、ERK(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶2 000)、Beclin1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶2 000)抗體4 ℃過夜孵育，TBST清洗后，HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶并拍照。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞T-cadherin表達(dá)、細(xì)胞活力及增殖能力比較 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與GES-1組相比，空白組的T-cadherin表達(dá)顯著降低；與NC組相比，T-cad組T-cadherin表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T-cad組48 h和72 h的細(xì)胞活力低于NC組，細(xì)胞克隆數(shù)亦顯著低于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B、1C)。

1A:Western blotting檢測細(xì)胞T-cadherin蛋白表達(dá)；1B：CCK-8檢測細(xì)胞活力；1C：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況；與GES-1組比較，#P<0.05；與陰性對照(NC)組比較，*P<0.05

2.2 各組細(xì)胞周期、凋亡和Bcl-2、Bax及cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平比較 與NC組相比，T-cad組G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)；T-cad組的細(xì)胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平顯著高于NC組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B、2C)。

2A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；2B：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；2C：Western blotting檢測Bcl-2、Bax及cleaved caspase 3蛋白表達(dá)；與陰性對照(NC)組比較，*P<0.05

2.3 各組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡比較 與NC組相比，HCQ組細(xì)胞的Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，T-cad組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)和細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與T-cad組相比，T-cad+HCQ組細(xì)胞的Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A、3B。

3A：Western blotting檢測細(xì)胞自噬蛋白Beclin1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)；3B：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；與陰性對照(NC)組比較，*P<0.05；與T-cad組比較，#P<0.05

2.4 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平比較 與NC組相比，T-cad組細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)

注：與陰性對照(NC)組比較，*P<0.05

2.5 各組細(xì)胞Wnt/ERK/PI3K-AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與NC組相比，T-cad組細(xì)胞的Wnt、β-catenin、p-ERK/ERK、PI3K和p-AKT/AKT表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

5A：Western blotting檢測Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)；5B：Western blotting檢測p-ERK和ERK蛋白表達(dá)；5C：Western blotting檢測PI3K、p-AKT和AKT蛋白表達(dá)。與陰性對照(NC)組比較，*P<0.05

3 討論

GC是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，由于GC的晚期診斷、耐藥性和轉(zhuǎn)移等因素，以及對GC發(fā)生和發(fā)展過程中涉及的分子機(jī)制缺乏了解，致使胃癌的治療效果仍不理想[11-12]。T-cadherin是鈣黏蛋白超家族中的成員之一，可以充當(dāng)信號受體，參與環(huán)境識別，并調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動性、增殖和表型[13-14]。T-cadherin對細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)涉及多種生物學(xué)過程，如運(yùn)動軸突的負(fù)向?qū)б?，胚胎發(fā)育過程中的后肢軌跡、細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤中的血管重塑[7]。T-cadherin參與調(diào)控多種癌癥的生物學(xué)進(jìn)展，而關(guān)于T-cadherin是否參與胃癌發(fā)生發(fā)展過程的相關(guān)研究寥寥無幾。

T-cadherin位于染色體16q24區(qū)域，該區(qū)域在多種癌癥中常受到致癌性修飾，T-cadherin表達(dá)的缺失與腫瘤細(xì)胞侵襲性和增殖能力的增強(qiáng)有關(guān)[15]。研究表明，T-cadherin的缺失和高甲基化可促進(jìn)人類非小細(xì)胞肺癌的致瘤性和進(jìn)展[16]。T-cadherin還可抑制子宮內(nèi)膜異位癥中子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的侵襲和遷移[17]。乙酰化酶抑制劑Garcinol通過上調(diào)T-cadherin的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞活力、集落形成、侵襲、遷移及細(xì)胞周期進(jìn)程，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，抑制異種移植模型中的腫瘤生長[18]。已有研究表明，上調(diào)T-cadherin抑制體外胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示，T-cadherin在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯于G1期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有證據(jù)表明，姜黃素通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果也顯示T-cadherin通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

越來越多的證據(jù)表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進(jìn)癌癥進(jìn)展[21-22]。EMT是上皮細(xì)胞失去其上皮特征并獲得間充質(zhì)表型的過程，該過程使癌細(xì)胞與原發(fā)腫瘤分離并遷移到其他組織。此外，EMT的特征是E-cadherin的喪失，這與間充質(zhì)相關(guān)蛋白(如Vimentin、N-cadherin)的表達(dá)增加有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，T-cadherin抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

Wnt/ERK/PI3K-AKT信號通路與人類癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。阻斷胃癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)可抑制其生長、增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移、侵襲、EMT和化療耐受性[24]。激活A(yù)KT/ERK通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，并降低胃癌細(xì)胞對順鉑和紫杉醇的敏感性[25]。研究表明，下調(diào)T-cadherin的表達(dá)可通過激活宮頸癌細(xì)胞中的P13K/AKT信號通路逆轉(zhuǎn)Garcinol對宮頸癌細(xì)胞發(fā)育的抑制作用[18]。本研究結(jié)果顯示，T-cadherin可抑制胃癌細(xì)胞中Wnt/ERK/PI3K-AKT信號通路活化。

綜上所述，T-cadherin可能通過抑制Wnt/ERK/PI3K-AKT信號通路活化從而抑制胃癌細(xì)胞增殖和EMT，促進(jìn)細(xì)胞自噬并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。