南麗麗，郭全恩，劉雪強(qiáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

微生物量碳氮和酶活性作為土壤微生物活性的重要指標(biāo)，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和有機(jī)質(zhì)分解的關(guān)鍵因子，常被用于評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的生物學(xué)特性[1-4]。土壤呼吸是土壤碳庫的主要輸出途徑，可以衡量土壤的生物活性，其大小能反映土壤的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和供應(yīng)能力[5]。大量研究表明，與單一連作的種植模式相比，在相同管理?xiàng)l件下與不同作物輪作能改變土壤微生物組成，增加細(xì)菌多樣性，保持地力，緩解連作障礙[6-7]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，在世界和中國廣泛栽培。然而，苜蓿生長多年會(huì)導(dǎo)致土壤自毒物質(zhì)的積累，隨著苜蓿生產(chǎn)年限的增加，土壤養(yǎng)分及水分會(huì)顯著下降，導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化，使苜蓿產(chǎn)量、品質(zhì)下降[8]?？茖W(xué)輪作可以有效緩解連作障礙引起的土壤環(huán)境惡化，使土壤中微生物活性增強(qiáng)、多樣性增加，為后續(xù)作物生長提供健康穩(wěn)定的土壤生態(tài)環(huán)境[9]。鑒于此，本試驗(yàn)以5年生紫花苜蓿地為研究對(duì)象，研究苜蓿長期生長及輪茬不同作物對(duì)土壤生物學(xué)活性及細(xì)菌群落多樣性的影響，旨在為荒漠灌區(qū)采用輪作措施消減紫花苜蓿連作土壤自毒效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為草地生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

1.2 試驗(yàn)材料與樣地

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共5個(gè)處理，分別為CK：6年生苜蓿地，T1：5年生苜蓿地輪作小麥(Triticumaestivum)，T2：5年生苜蓿地輪作油菜(Brassicachinensis)，T3：5年生苜蓿地輪作葵花(Helianthusannuus)，T4：5年生苜蓿地輪作玉米(Zeamays)，每個(gè)處理3次重復(fù)。供試苜蓿、小麥、油菜、葵花、玉米品種分別為‘甘農(nóng)3號(hào)’紫花苜蓿(M.sativaL.‘Gannong No.3’)、‘隴春29號(hào)’(T.aestivum.‘Longchun No.29’)、‘圣光402’(B.chinensis‘Shenguang No.402’)、‘食葵LD5009’(H.annuus‘No.LD5009’)、‘隴單10號(hào)’(Z.mays‘Longdan No.10’)，種子均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

2014年7月15日人工開溝條播苜蓿，播深2 cm，播量20.0 kg·hm-2，行距20 cm，小區(qū)面積667 m2；2018年9月底用機(jī)械挖除苜蓿(留100 m2苜蓿地)，人工撿拾苜蓿根系，于2019年4月25日在連種5年苜蓿地上，人工開溝條播小麥和油菜(行距20 cm)、覆膜點(diǎn)播玉米和葵花(行距20 cm，株距20 cm)，播種量分別為150.0 kg·hm-2，15.0 kg·hm-2，150.0 kg·hm-2，15.0 kg·hm-2，除油菜播深為1～2 cm外，其余播深均為3～4 cm，每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)面積20 m2(4 m×5 m)，播前澆一次底墑水，未施肥，田間管理一致。于2019年9月14日用土鉆在各小區(qū)按“S”形路線5點(diǎn)取樣法采取0～20 cm土層土樣，3次重復(fù)。土樣混勻后裝入已滅菌袋中用冰盒迅速帶回。將土樣分為兩份，一份在4℃冰箱中保存用于土壤生物學(xué)指標(biāo)測定，另一份在-80℃冰箱中保存用于土壤微生物總DNA提取。

1.3 土壤生物學(xué)指標(biāo)測定

土壤微生物量碳(soil microbial biomass carbon，SMBC)含量[10]、土壤微生物量氮(soil microbial biomass nitrogen，SMBN)含量[11]采用氯仿熏蒸法測定，

SMBC=EC/KEC

EC=熏蒸土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)-未熏蒸土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

SMBN=EN/KEN

EN=熏蒸土壤全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)-未熏蒸土壤全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

KEC：轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.38；KEN：轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.45。

土壤脲酶活性(Urease activity，UA)采用靛酚藍(lán)比色法測定[12]，以24 h后1 g土壤中NH3-N質(zhì)量(mg)表示；堿性磷酸酶活性(Alkaline phosphatase activity，APA)采用磷酸苯二鈉(用硼酸緩沖液)比色法測定[12]，以24 h后1 g土壤中釋放出的酚質(zhì)量(mg)表示；蔗糖酶活性(Sucrase activity，SA)采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，以24 h后1 g土壤中的葡萄糖的質(zhì)量(mg)表示[12]；過氧化氫酶活性(Catalase activity，CA)采用紫外分光光度法測定[13]，以20 min內(nèi)1 g土壤中分解的過氧化氫的質(zhì)量(mg)表示；土壤呼吸速率(Soil respiration，SR)采用LICOR-6400便攜式光合作用儀連接6400-09土壤葉室(Li-Cor Inc，Lincoln，NE，USA)測定[14]，每次測定時(shí)，齊地面剪去管中的作物；測定所用PVC基座直徑10 cm、高5 cm，提前24 h嵌入土中約3 cm，每個(gè)小區(qū)3次重復(fù)；pH值采用土水比1∶5懸液用pHS-4智能酸度計(jì)測定。

1.4 土壤總DNA提取及細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增

采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyammonium ammonium bromide，CTAB)方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因V4區(qū)采用帶Barcode的特異性引物[15](515F和806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次重復(fù)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。

第二，學(xué)校要完善社團(tuán)的申報(bào)制度。學(xué)生社團(tuán)需要上報(bào)社團(tuán)的學(xué)期計(jì)劃、社團(tuán)成員的名單、社團(tuán)的活動(dòng)開展情況及每學(xué)期的社團(tuán)的工作總結(jié)。

1.5 生物信息學(xué)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從測定數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接[16]后得到原始測序數(shù)據(jù)；原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)檢和嵌合體去除得到有效數(shù)據(jù)(effective tags)。利用Uparse軟件對(duì)樣品的有效序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類(相似度97%以上)，用Mothur方法[17]與Silva軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[18]進(jìn)行物種注釋(設(shè)定閾值為0.8～1.0)；采用MUSCLE(3.8.31)軟件[19]進(jìn)行快速多序列比對(duì)，最后對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Qiime(1.9.1)軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，使用R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線。Alpha多樣性指數(shù)中，Chao1和Observed-species為菌群豐度指數(shù)。Chao1計(jì)算公式為：

式中，Sobs是觀察到的物種數(shù)，n1是觀察到的Singletons的種類數(shù)，n2是觀察到的Doubletons的種類數(shù)。

Observed-species為試驗(yàn)中檢測出的種類數(shù)；

式中，H表示Shannon Index值，R表示樣品中物種的種類數(shù)，pi第i個(gè)物種所占百分比；Simpson反映一個(gè)種群的優(yōu)勢度，Simpson公式如下：

D=1-∑pi2

式中，pi表示物種i在樣品中的比例。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理分析，One-way ANOVA和Duncan氏新復(fù)極差法分析差異顯著性。采用CANOCO 4.0軟件對(duì)豐度前10的細(xì)菌門優(yōu)勢群落與土壤環(huán)境指標(biāo)間的相互關(guān)系進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理土壤生物學(xué)性質(zhì)分析

由表1可知，不同處理對(duì)土壤生物學(xué)各指標(biāo)均有顯著影響(P<0.05)。其中微生物量碳含量、微生物量氮含量、土壤呼吸速率、pH值變化范圍分別為120.61～360.31 mg·kg-1，54.82～101.74 mg·kg-1，4.38～11.10 μmol CO2·m-2·s-1，8.02～8.36，微生物量碳含量以T2處理最大，微生物氮含量和土壤呼吸速率以T4處理最高，pH值以CK最大；與CK相比，處理T1，T2，T3，T4的脲酶活性較CK處理分別增加了44.38%，13.03%，35.76%，53.98%，堿性磷酸酶活性是CK處理的1.53，7.78，4.25，7.28倍，過氧化氫酶活性較CK處理分別提高了8.96%，27.90%，13.56%，6.24%，蔗糖酶活性是CK處理的1.11，1.38，1.14，1.74倍。

2.2 土壤細(xì)菌群落豐度與Alpha多樣性分析

由表2可知，通過Illumina HiSeq PE250高通量測序，得到有效序列、優(yōu)質(zhì)序列、OTUs分別為84 221～93 784條、75 522～82 720條、3 004～3 250個(gè)。各樣品文庫的覆蓋度均在98%以上，并結(jié)合樣品稀釋曲線均趨于平緩，說明本研究測序數(shù)據(jù)合理，能夠準(zhǔn)確反映出土壤細(xì)菌群落的真實(shí)信息(圖1)。不同處理土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)和ACE指數(shù))為T2>T1>CK>T3>T4；細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Simpson和Shannon-wiener指數(shù))依次分別為CK=T1=T3>T2=T4，CK>T1>T3>T2>T4。如圖2所示，所有樣品中共有OTUs數(shù)目為2 712個(gè)，其中處理CK，T1，T2，T3，T4中所特有的OTUs數(shù)目分別為322，236，253，180和235個(gè)。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for samples

圖2 樣品韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of samples

表1 各樣地土壤生物學(xué)性質(zhì)Table 1 Soil biological properties of different soil sampling sites

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)、豐富度與多樣性指數(shù)Table 2 Statistics of sample sequence numbers,and richness and diversity index

2.3 苜蓿后茬輪作不同作物土壤細(xì)菌群落分布特征分析

2.3.1門水平上的群落組成 由圖3可知，各處理細(xì)菌群落相對(duì)豐度前10的細(xì)菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria)(38.02%～44.69%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(15.37%～21.80%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(9.72%～14.08%)、放線菌門(Actinobacteria)(7.50%～12.51%)、類桿菌門(Bacteroidetes)(2.67%～5.43%)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)(0.03%～4.42%)、奇古菌門(Thaumarchaeota)(0.22%～3.96%)、厚壁菌門(Firmicutes)(0.85%～3.88%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(2.73%～3.57%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria)(0.75%～1.74%)，共占細(xì)菌總數(shù)的94.21%～96.12%。其中變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門相對(duì)豐度占細(xì)菌總數(shù)的79.32%～86.01%，說明這4個(gè)門的細(xì)菌為優(yōu)勢菌群。不同處理細(xì)菌在門分類水平上，相對(duì)豐度存在一定的變化趨勢。與CK處理相比，輪茬后其變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、棒狀桿菌門相對(duì)豐度呈減小趨勢，其中T1，T2，T3，T4處理放線菌門、厚壁菌門、棒狀桿菌門相對(duì)豐度較CK處理分別下降了15.59%，5.27%，1.78%和21.69%，11.75%，25.14%，24.28%和36.44%，5.25%，9.05%，23.30%和42.00%；而酸桿菌門、類桿菌門、藍(lán)藻門、奇古菌門相對(duì)豐度呈增大趨勢，藍(lán)藻門、奇古菌門相對(duì)豐度T1，T2，T3，T4處理是CK的3.72，1.89，2.74，28.27倍，2.41，4.87，1.67，2.64倍。

圖3 不同處理門分類水平下土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacterial community at phylum level of different treatments

2.3.2屬水平上的群落組成 由圖4可知，各處理細(xì)菌群落相對(duì)豐度前10的細(xì)菌屬分別為：鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、未分類酸桿菌屬、未分類膠鞘藻屬(Coleofasciculaceae)、抗銻斯科曼氏球菌屬(Skermanella)、摩根氏菌屬(Morganella)、Haliangium屬、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、Stenotrophobacter屬、溶桿菌屬(Lysobacter)、交替紅桿菌屬(Altererythrobacter)，相對(duì)豐度低于1%的類群占80.64%～86.28%。5齡苜蓿地輪作不同作物土壤細(xì)菌在屬分類水平上，相對(duì)豐度存在一定變化趨勢。與CK處理相比，其鞘氨醇單胞菌屬(T3處理除外)、未分類膠鞘藻屬、摩根氏菌屬、芽單胞菌屬、Stenotrophobacter屬、溶桿菌屬(T4處理除外)相對(duì)豐度呈增大趨勢，而未分類酸桿菌屬、抗銻斯科曼氏球菌屬、Haliangium屬、交替紅桿菌屬(T4處理除外)相對(duì)豐度呈降低趨勢。

圖4 不同處理屬分類水平下土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of soil bacterial community at genus level of different treatments

2.4 細(xì)菌優(yōu)勢類群與土壤環(huán)境因子間RDA分析

通過RDA分析表明：第一、二排序軸累計(jì)解釋率分別為25.53%和17.70%(圖5)。其中，類桿菌門、藍(lán)藻門、變形菌門相對(duì)豐度與土壤呼吸速率、微生物量氮含量、脲酶活性、pH值呈正相關(guān)；酸桿菌門、奇古菌門相對(duì)豐度與堿性磷酸酶和蔗糖酶活性呈正相關(guān)，與微生物量碳含量、過氧化氫酶活性呈負(fù)相關(guān)；厚壁菌門、棒狀桿菌門、綠彎菌門、放線菌門相對(duì)豐度與微生物量碳含量、過氧化氫酶活性呈正相關(guān)，與蔗糖酶和堿性磷酸酶活性呈負(fù)相關(guān)；芽單胞菌門相對(duì)豐度與堿性磷酸酶活性呈正相關(guān)，與其他環(huán)境因子均呈負(fù)相關(guān)。

圖5 細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子冗余分析Fig.5 Redundancy analysis for bacterial community and soil environmental factors注：x1,x2,x3,x4,x5,x6,x7,x8分別代表土壤呼吸速率，微生物量碳含量，微生物量氮含量，脲酶活性，堿性磷酸酶活性，過氧化氫酶活性，蔗糖酶活性，pH值Note: x1,x2,x3,x4,x5,x6,x7,x8 represent soil respiration, soil microbial biomass carbon, soil microbial biomass nitrogen, urease, alkaline phosphatase, catalase, sucrase, and pH value, respectively

3 討論

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受種植作物的影響[20]，作物種類不同其土壤微生物所處環(huán)境不同，細(xì)菌組成和豐度大小有差異，不同的農(nóng)田土壤中存在共有和特異的細(xì)菌種群[21]。本研究表明，不同處理下土壤細(xì)菌主要門類為變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門，這與禾豆混播草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)論相似[22]，但與荒漠灌區(qū)苜蓿后茬分別輪作1年玉米和小麥、2年玉米和小麥后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)論不完全一致[23]，這可能與后茬作物種類、輪作時(shí)間長短有關(guān)[24]。與苜蓿連作(CK)相比，苜蓿后茬輪作不同作物后其變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門相對(duì)豐度呈降低趨勢，而酸桿菌門相對(duì)豐度呈增加趨勢。變形菌門在苜蓿連作(CK)處理中相對(duì)豐度最高，這可能是因?yàn)檐俎８鼍鷮儆讦?變形菌，其連作有利于苜蓿土壤中根瘤菌的成長和積累[2]；此外，也可能是由于變形菌門具有較好的耐鹽性[25]，在鹽堿土壤中(本研究pH為8.01～8.36)相對(duì)豐度較高[26-27]。酸桿菌門是嗜酸性細(xì)菌，堿性土壤環(huán)境不利于其生長，所以在堿性環(huán)境中酸桿菌門細(xì)菌豐度相對(duì)較低[28]，但本研究結(jié)果卻表明酸桿菌門細(xì)菌是僅次于變形菌門細(xì)菌的第二優(yōu)勢種群，這可能是因?yàn)檐俎５剌啿缱魑锖笪词┓?，作物?duì)土壤養(yǎng)分的消耗使土壤肥力下降，而酸桿菌門可以較好的生長在土壤養(yǎng)分較缺的環(huán)境中[29]。放線菌適宜生長在中性偏堿性pH值的土壤中[30]，而輪作降低了土壤pH值，故苜蓿后茬輪作不同作物后土壤細(xì)菌放線菌門相對(duì)豐度有所降低。厚壁菌對(duì)土壤病原真菌具有拮抗作用[31]，而本研究輪茬處理土壤中，厚壁菌相對(duì)豐度低于連作土壤，這與江淮地區(qū)苜蓿后茬輪作玉米、高粱后厚壁菌門在連作土壤中最高的研究結(jié)論相似[2]，但與黑胡椒(Pipernigrum)隨連作年限的增加，其厚壁菌相對(duì)豐度呈逐年降低的結(jié)論不一致[31]，其原因可能與作物種類有關(guān)，苜蓿連作可能有利于厚壁菌的積累及生長。

Alpha多樣性可分析樣品內(nèi)菌種類別的豐富度和菌種數(shù)目的均勻度，Alpha多樣性越高，細(xì)菌種類越豐富，群落越穩(wěn)定[32]。本研究結(jié)果表明，苜蓿后茬輪作不同作物后Shannon指數(shù)無顯著性變化，說明樣地土壤細(xì)菌群落均勻度較高，可能是因?yàn)闃拥鼐哂邢嗤奶镩g管理模式，因此細(xì)菌群落具有較好的均勻性。本研究Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，處理T1，T2均高于CK，處理T3，T4均低于CK，說明輪茬油菜、小麥會(huì)使細(xì)菌豐富度和多樣性上升，土壤活力增強(qiáng)，肥力更高，營養(yǎng)元素的循環(huán)代謝更為高效，而輪茬葵花和玉米不及苜蓿連作，可能是由于不同輪茬作物根系分泌物的不同影響了土壤細(xì)菌群落多樣性[33]。

土壤酶活性大小可以反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的能力，脲酶和堿性磷酸酶參與氮磷循環(huán)和有機(jī)質(zhì)分解，過氧化氫酶能減輕生物體內(nèi)的毒素，蔗糖酶能夠催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，進(jìn)而提高土壤生物學(xué)活性，增加土壤營養(yǎng)[34]。本研究表明，苜蓿后茬輪作后土壤脲酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶活性均顯著高于苜蓿連作(CK)，與李爭艷等[2]的研究結(jié)果相似。其研究表明，輪茬玉米與高粱后土壤過氧化氫酶及脲酶活性均顯著高于苜蓿連種土壤。張鵬鵬等[35]在棉花、小麥玉米輪作試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)輪作能夠提高土壤過氧化氫酶、蔗糖酶及相關(guān)酶活性。綜上，輪茬處理提高了土壤酶活性，增強(qiáng)了土壤的氧化還原能力，提高了養(yǎng)分的吸收及循環(huán)水平。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)研究了荒漠灌區(qū)5年生苜蓿地輪作不同作物后土壤細(xì)菌的群落特征。結(jié)果顯示，輪茬不同作物后，土壤脲酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶及蔗糖酶活性均顯著高于苜蓿連作；微生物量碳含量、微生物量氮含量和土壤呼吸速率分別以輪茬小麥和油菜、玉米、葵花和玉米最大；土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門，輪茬后變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門相對(duì)豐度呈降低趨勢，酸桿菌門相對(duì)豐度呈增加趨勢；輪茬小麥和油菜后土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)Chao1和ACE均顯著高于苜蓿連作。