司家屹，王祎琛，毛俊儼，楊秀云

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，功能油料樹種培育與利用山西省重點實驗室，山西 太谷 030801)

植物揮發(fā)性物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)生的具有揮發(fā)性的小分子有機化合物[1]，具有重要的觀賞、經(jīng)濟和醫(yī)藥價值[2-4]，對于植物自身抵御逆境、促進繁殖、適應(yīng)環(huán)境也具有重要意義[5-7]。由于植物自身狀態(tài)以及外界環(huán)境條件的改變，植物揮發(fā)物的合成與釋放是動態(tài)變化的，并呈現(xiàn)一定的節(jié)律[8]。研究表明植物揮發(fā)物的合成與釋放存在以24小時為周期的日變化，即晝夜節(jié)律。例如山桃草(GauralindheimeriEngelm. et Gray)在白天揮發(fā)物釋放量大[9]，而東方百合‘西伯利亞’(Lilium‘Siberia’)釋放的萜烯類化合物在一天當(dāng)中呈先升高后降低的趨勢[10]。光照是使植物體內(nèi)生物鐘與晝夜變化同步的一種授時因子，也是影響植物代謝的重要因素[11]。正常光照下植物會通過生物鐘核心調(diào)控元件對環(huán)境中光照信號進行整合，協(xié)調(diào)代謝活動[12]。給予植物黑暗處理時，光照因子劇烈變化，植物代謝也變化劇烈。研究黑暗處理下與正常光照下?lián)]發(fā)性物質(zhì)的日變化規(guī)律，對于揭示黑暗對揮發(fā)性物質(zhì)釋放的影響具有重要意義。

百里香(Thymusmongolicus)是唇形科百里香屬植物，不僅具有觀賞價值，還具有很高的經(jīng)濟與生態(tài)價值，可用于食用、藥用、畜牧、蜜源、園林觀賞、防風(fēng)固沙等方面[13-14]。并且百里香全株具有香氣，也是一種具有開發(fā)價值的芳香植物。本試驗將長勢一致、無病蟲害的當(dāng)年生百里香分別置于黑暗處理和正常光照中，使用氣質(zhì)聯(lián)用法(HS-SPME/GC-MS)對其釋放的揮發(fā)性物質(zhì)進行采集，探究黑暗處理對百里香揮發(fā)物釋放日變化節(jié)律的影響，為探明植物揮發(fā)物釋放機理提供一定理論基礎(chǔ)，同時為百里香的有效開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

百里香種源來源于山西省渾源縣自然生長的群落(經(jīng)度113 °72 ′66.97 ″，緯度39 °63 ′77.52 ″，海拔1 363.45 m，無霜期140 d，年均氣溫6.2℃，年降水量388.0 mm，年日照時數(shù)2 627.0 h)，2015年引種到山西農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃種植。2019年5月12日選擇長勢一致的當(dāng)年生百里香枝條進行扦插繁殖，將其均栽植于7 cm×7 cm的花盆中，栽培基質(zhì)為混合土壤(混合土壤的體積比為原土∶砂土∶腐殖質(zhì)=2∶1∶1)。管理過程中的水、肥及光照條件保持一致，2019年9月12日選取枝葉繁茂、無病蟲害、長勢一致的百里香扦插苗進行試驗處理。

1.2 試驗方法

試驗設(shè)置2個處理，每個處理重復(fù)3次。對照組為置于正常光照環(huán)境下的百里香，試驗組于試驗當(dāng)天早晨6:00采用PVC黑色遮蔭網(wǎng)進行處理，遮蔭棚南北向放置，便于通風(fēng)透氣，東西向遮蔭網(wǎng)設(shè)于距地面150 cm處。(試驗各時段采用TES-1334A照度計測定光照，均為0 lux)花盆之間保持30 cm以上的距離，避免植株冠層間受光干擾影響。采用多株混合取樣法，每隔4小時(取樣時間為0:00；4:00；8:00；12:00；16:00；20:00)采集長勢一致、位置相同的百里香健康葉片。將采集葉片用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙擦干，混勻后精確稱取0.50 g放置于5 mL萃取瓶中密封。

揮發(fā)物質(zhì)測定方法采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME/GC-MS)技術(shù)[15]。GC(Gas Chromatography，trace 1300型號，Thermo Fisher公司生產(chǎn))條件設(shè)計為色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱，起始溫度為40℃，停留3 min，以5℃·min-1升溫270℃，停留6 min。進樣口溫度為270℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL·min-1，不分流進樣。萃取頭為DVB/CAR/PDMS，50℃震蕩15 min，吸附5 min，進樣口270℃解吸附5 min。MS(Mass Spectrometry，trace ISQ型號，Thermo Fisher公司生產(chǎn))質(zhì)譜的離子源為EI源，離子傳輸線250℃，離子源溫度為230℃，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NBS對采集到的質(zhì)譜圖進行檢索，采取峰面積歸一化法計算檢測出的化學(xué)物質(zhì)的相對含量(將樣品中所有能檢測出峰的化合物的峰面積之和視作1，每個組分的峰面積與總峰面積的百分比代表其相對含量)[16]。使用Excel 2013進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑暗處理對揮發(fā)物種類日變化的影響

正常光照下的百里香在6個采樣時間內(nèi)共檢測出80種揮發(fā)性物質(zhì)，而黑暗處理下檢測出揮發(fā)物質(zhì)77種。主要包括烯烴類、芳香烴類、醇類、酚類和酯類5大類。其中烯烴類揮發(fā)物種類數(shù)明顯高于其余類別的化合物。黑暗處理對百里香釋放的揮發(fā)物質(zhì)種類波動趨勢有明顯的影響，正常光照下?lián)]發(fā)物種類出現(xiàn)兩個低谷(12∶00和0∶00)，種類數(shù)分別為36種和33種，揮發(fā)物種類峰值出現(xiàn)在8∶00，檢測出50種揮發(fā)物，其余3個時段均檢測出41種揮發(fā)物。黑暗處理下?lián)]發(fā)物種類的波動趨于平緩，夜間釋放種類數(shù)量基本相等(20∶00，0∶00，4∶00分別為38種、36種和37種)，早8∶00釋放種類30種，12∶00和16∶00分別釋放種類26種和25種。

不同類型揮發(fā)物對黑暗處理的響應(yīng)不同。正常光照和黑暗處理下烯烴類揮發(fā)物的日變化均呈波動趨勢，但正常光照下的波動較大，范圍為15～27種，黑暗處理下的波動較小，范圍為12～17種。芳香烴類正常光照下數(shù)量在5～7種范圍內(nèi)波動，黑暗處理下8∶00釋放最多為9種，其余時間為4～5種。黑暗處理對醇類化合物數(shù)量日變化趨勢也有影響，正常光照下最大值出現(xiàn)在8∶00(9種)，最小值出現(xiàn)在12∶00(5種)，黑暗處理下的醇類揮發(fā)物數(shù)量在白天少(8∶00-16∶00為1～3種)，在夜晚多(20∶00-4∶00為6～8種)。正常光照下酚類揮發(fā)物數(shù)量最大值出現(xiàn)在16∶00(為3種)，0∶00揮發(fā)物數(shù)量最少(1種)，黑暗處理下12∶00、16∶00未釋放酚類揮發(fā)物，其余時間均釋放了1種。酯類揮發(fā)物數(shù)量在正常光照下8∶00-12∶00上升(2～4種)，之后變化較為和緩(1～2種)，在黑暗處理組中8∶00-16∶00上升(0～4種)，16∶00-0∶00下降(4～2種)。

圖1 正常光照及黑暗處理兩種處理對揮發(fā)物種類日變化的影響Fig.1 Effects of normal and dark treatments on diurnal variation of volatile species

2.2 黑暗處理對不同揮發(fā)物相對含量日變化的影響

2.2.1黑暗處理對烯烴類揮發(fā)物相對含量日變化的影響 研究表明(表1)，烯烴類物質(zhì)是百里香揮發(fā)性物質(zhì)的主要種類，黑暗處理對于烯烴類揮發(fā)物的日變化趨勢及幅度均有影響。黑暗處理組的烯烴類揮發(fā)物相對含量變化范圍為38.24%～51.47%，正常光照組的為44.08%～49.58%，黑暗處理組的變化范圍是正常光照組的41.57%。正常光照下烯烴類揮發(fā)物相對含量在20∶00時出現(xiàn)低谷(38.24%)，其余時段相對含量變化平緩(48.50%～51.50%)。黑暗處理下4∶00和8∶00烯烴類化合物相對含量出現(xiàn)高峰(分別為48.01%和49.58%)，其余時段釋放較少(44.08%～46.72%)。

有7種烯烴類物質(zhì)是所有樣本共有的，黑暗處理對不同物質(zhì)相對含量日變化有不同影響。正常光照下的r-萜品烯相對含量呈升高-降低-升高-降低的趨勢，黑暗處理下的僅在12∶00-20∶00時變化趨勢與正常的相反，其余時間相同。正常光照下和黑暗處理下水芹烯相對含量日變化均較小。4-甲基-1-異丙基二環(huán)[3.1.0]己-2-烯相對含量在正常光照下呈下降-上升-下降趨勢，8∶00出現(xiàn)高峰(4.38%)，黑暗處理下出現(xiàn)高峰的時間提前到4∶00(4.03%)，其余時間較為和緩(3.01%～3.41%)。光照下8∶00,12∶00檜烯的相對含量較高(0.97%～1.67%)，黑暗處理下4∶00的相對含量最高(1.07%)，其余時間正常光照和黑暗處理下的檜烯相對含量變化均較小(0.62%～0.74%)。正常光照下莰烯相對含量在8∶00-20∶00從3.11%下降至0.09%，到0∶00和4∶00有所升高(2.57%和2.25%)，黑暗處理的則在1.01%～2.05%范圍內(nèi)不斷波動。大牛兒烯D在正常光照下的變化趨勢與r-萜品烯的一致，但在黑暗處理下呈先下降再上升趨勢，且變化幅度更小。正常光照下Δ-杜松烯在12∶00與20∶00釋放較少，僅為0.40%，16∶00釋放較多，為2.25%，黑暗處理的僅8∶00釋放較多(1.06%)。

表1 百里香葉片中烯烴類揮發(fā)物相對含量日變化Table 1 Diurnal variation of relative content of olefin volatiles in Thymus mongolicus leaves

續(xù)表1

Note∶"-" means the presence of this volatile substance is not detected in this sample,the same as below

2.2.2黑暗處理對芳香烴類揮發(fā)物相對含量日變化的影響 黑暗處理下的芳香烴類揮發(fā)物相對含量均大于正常光照下的，并且黑暗處理對其日變化有影響。黑暗處理組的芳香烴類揮發(fā)物相對含量變化范圍為20.17%～26.38%，正常光照組的為28.50%～32.29%，黑暗處理組的變化范圍是正常光照組的61.03%。0∶00時正常光照下的芳香烴類揮發(fā)物相對含量較高(26.38%)，其余時間較為和緩(20.17%～23.65%)。黑暗處理中的則在8∶00-20∶00釋放較多(30.72%～32.29%)，0∶00，4∶00釋放較少(28.50%，29.06%)。

檢測出的11種芳香烴類揮發(fā)物中，鄰-異丙基苯和2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯是所有檢測樣本中共有的。正常光照與黑暗處理下，鄰-異丙基苯最小值均出現(xiàn)在8∶00(正常光照下為15.61%，黑暗處理下為23.52%)，正常光照下最大值出現(xiàn)在0∶00(22.59%)，黑暗處理下最大值出現(xiàn)在16∶00(29.67%)。正常光照下2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯日變化在4∶00時出現(xiàn)高峰(6.07%)，其余時段相對含量變化平緩(2.50%～4.08%)，而黑暗處理下的則在1.69%～2.72%區(qū)間內(nèi)波動。

表2 百里香葉片中芳香烴類揮發(fā)物相對含量日變化Table 2 Diurnal variation of relative content of aromatic hydrocarbon volatiles in Thymus mongolicus leaves

續(xù)表2

2.2.3黑暗處理對醇類揮發(fā)物相對含量日變化的影響 黑暗處理導(dǎo)致醇類揮發(fā)物相對含量日變化波動幅度減小，黑暗處理組的醇類揮發(fā)物相對含量變化范圍為4.71%～14.18%，正常光照組的為5.39%～9.45%，黑暗處理組的變化范圍是正常光照組的42.87%。正常光照下的醇類揮發(fā)物相對含量呈下降-上升-下降-上升的波動趨勢，相對含量最大值為20∶00的14.18%，最低值為0∶00的4.71%。所有時段，黑暗處理的日變化趨勢與正常光照的均相反，但變化幅度較小(5.39%～9.45%)。

在不同時間所有樣本中均有檢測到桉葉油醇。一天中正常光照下桉葉油醇相對含量的呈下降-上升-下降趨勢，20∶00相對含量最高(11.58%)，0∶00相對含量最低(4.21%)，黑暗處理下的則在5.39%～9.45%間波動。

表3 百里香葉片中醇類揮發(fā)物相對含量日變化Table 3 Diurnal variation of relative content of alcohols volatiles in Thymus mongolicus leaves

續(xù)表3

2.2.4黑暗處理對酚類揮發(fā)物相對含量日變化的影響 正常光照下，8∶00-16∶00酚類相對含量變化幅度較小(1.00%～1.88%)，20∶00，4∶00釋放較多(3.48%，4.52%)，0∶00酚類相對含量最低(0.01%)。黑暗處理下酚類揮發(fā)物相對含量日變化較小，各時段的均小于1.00%，且12∶00和16∶00時未在樣本中檢測到酚類揮發(fā)物。

正常光照下百里酚相對含量在4∶00，8∶00釋放較多(1.40%，0.79%)，其余時間釋放較少(0.00%～0.26%)，黑暗處理組中則未檢測到其存在。香芹酚在正常光照組的所有樣本中均有釋放，日變化趨勢與酚類揮發(fā)物的相同，黑暗處理組的僅在20∶00與4∶00釋放。

表4 百里香葉片中酚類揮發(fā)物相對含量日變化Table 4 Diurnal variation of relative content of phenols volatiles in Thymus mongolicus leaves

2.2.5黑暗處理對酯類揮發(fā)物相對含量日變化的影響 正常光照下和黑暗處理下的百里香葉片中檢測出的酯類揮發(fā)物相對含量均較少，日變化幅度也均不明顯在0.00%～0.44%范圍內(nèi)波動。同時段正常光照的和黑暗處理的酯類揮發(fā)物相對含量存在差異。

正常光照下的百里香在6個檢測時間中均釋放了乙酸乙酯，12∶00相對含量最大，為0.27%，其余時間釋放均較少，在0.02%～0.09%范圍內(nèi)變化。黑暗處理對乙酸乙酯日變化具有影響，黑暗處理的乙酸乙酯相對含量日變化呈先上升后下降趨勢，在16∶00最大(0.07%)，4∶00與8∶00未檢測出乙酸乙酯。

表5 正常光照下百里香葉片中酯類揮發(fā)物相對含量日變化Table 5 Diurnal variation of relative content of esters volatiles in Thymus mongolicus leaves

2.2.6黑暗處理對其它揮發(fā)物相對含量日變化的影響 其它揮發(fā)物都為相對含量較低、同類化合物較少的揮發(fā)物，無明顯日變化趨勢。其中，黑暗處理組中均有釋放(3E2E)-2-亞乙基-6-甲基-3,5-二烯醛，20∶00含量最高(0.18%)，其余時間變化平穩(wěn)(0.01%～0.08%)，正常光照的僅在12∶00和0∶00檢出，相對含量分別為0.08%和0.24%。其他揮發(fā)物僅在極少的樣本中被檢測到，相對含量也較低。

表6 百里香葉片中其它揮發(fā)物相對含量日變化Table 6 Diurnal variation of relative content of other volatiles in Thymus mongolicus leaves

續(xù)表6

3 討論

黑暗環(huán)境會影響影響各類揮發(fā)物的釋放，但由于植物體內(nèi)次生代謝途徑多樣，各類揮發(fā)物受黑暗影響的機理也不同[17-18]。植物次生代謝會產(chǎn)生多種萜類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)近40 000種[19-20]，本研究中百里香釋放的大部分烯烴類物質(zhì)及芳樟醇、萜烯醇、桉葉油醇等部分烯烴含氧衍生物均為萜類化合物，釋放的總的相對含量與總種數(shù)均較多，與劉敏等人對黑黃檀(DalbergiafuscaPierre)、降香黃檀(DalbergiaodoriferaT. Chen)的研究結(jié)果一致[21]。光照是植物進行生命活動的重要生態(tài)因子，萜類化合物的合成對光照也十分敏感[22]。本研究中，黑暗處理下百里香釋放的烯烴類化合物的相對含量與種類數(shù)均小于正常光照，一方面是由于光照是影響光合作用的重要因子，光合作用是植物體內(nèi)主要的供能反應(yīng)，同時其產(chǎn)物也是許多次生代謝的前體物質(zhì)，從能量與物質(zhì)兩方面都干擾著烯烴類化合物的合成[23-24]；另一方面光照會提高萜類相關(guān)合成酶基因的表達量，Kawoosa等人[25]對胡黃連研究發(fā)現(xiàn)光照下與萜類合成有關(guān)的pkhmgr和pkdxs酶表達量更高，使前體物質(zhì)分配至萜類代謝途徑更多。

芳香烴類揮發(fā)物是草莽酸代謝途徑的重要產(chǎn)物。苯丙氨酸是草莽酸代謝途徑的重要前體物質(zhì)，在黑暗環(huán)境下會不斷積累[26]，黑暗處理下百里香芳香烴類揮發(fā)物相對含量較光照的更高，變化幅度也較光照的更小。酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)主要通過苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸-CoA聯(lián)結(jié)酶是此途徑的3個關(guān)鍵酶[27]。

光照會誘導(dǎo)苯丙烷代謝途徑中苯丙氨酸解氨酶活性增強[28]，產(chǎn)生酚類物質(zhì)，本研究中黑暗處理下的中百里香缺少光照的誘導(dǎo)，因而釋放的酚類物質(zhì)相對含量較低。此外，黑暗環(huán)境下無紫外線也是酚類化合物釋放較少的重要原因，自然光中含有的紫外光會對植物細(xì)胞造成紫外線損傷，植物通過合成酚類化合物使到達細(xì)胞的紫外線減少從而減少損傷，已有研究發(fā)現(xiàn)山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)和桃(AmygdaluspersicaL.)在紫外線照射后酚類化合物含量增加[29-30]。

植物釋放總揮發(fā)物是次生代謝產(chǎn)生的各種揮發(fā)物的集合，其合成與釋放具有日變化規(guī)律，但不同植物日變化趨勢不同[31-32]。一天中百合(Liliumbrowniivar.viridulum)[10]、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)[33]等植物釋放的揮發(fā)物數(shù)量呈先增加后降低的趨勢，毛竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.) Mitford ‘Pubescens’)[34]揮發(fā)物數(shù)量日變化趨勢則表現(xiàn)為上升-下降-上升-下降。本研究發(fā)現(xiàn)，正常光照下百里香揮發(fā)物數(shù)量呈下降-上升-下降-上升趨勢，低谷期為12∶00和0∶00，高峰期為8∶00。植物生物鐘核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以分為中心循環(huán)、早晨循環(huán)和傍晚循環(huán)[35]，本研究中黑暗處理下百里香在各時段揮發(fā)物數(shù)量均減少，且白天(8∶00，12∶00和16∶00)與夜間相比影響大，這可能是由于調(diào)控百里香揮發(fā)物釋放的早晨循環(huán)受光照影響大，黑暗處理阻礙部分揮發(fā)物代謝，導(dǎo)致白天黑暗處理的比正常光照的揮發(fā)物數(shù)量減少，而傍晚循環(huán)受光照影響小，導(dǎo)致黑暗處理的與正常光照的揮發(fā)物數(shù)量相近。

4 結(jié)論

正常光照和黑暗環(huán)境下，百里香釋放的揮發(fā)性物質(zhì)主要為烯烴類、芳香烴類、醇類、酚類和酯類5大類，其中烯烴類揮發(fā)物數(shù)量與相對含量均明顯高于其余類別的化合物。黑暗環(huán)境對于百里香揮發(fā)物數(shù)量日變化具有影響，減少了揮發(fā)物總數(shù)量，并且最大值與最小值出現(xiàn)時間發(fā)生改變。黑暗處理同樣使各類揮發(fā)物相對含量最大值最小值出現(xiàn)時間改變，并且減小了揮發(fā)物相對含量日變化波動幅度?？梢姾诎堤幚頃Π倮锵銚]發(fā)性物質(zhì)的合成與釋放產(chǎn)生影響。