徐穎娟，方澤漫，吳彩茹，黃慶軍，張瀚迪

(汕頭大學(xué)精神衛(wèi)生中心，廣東 汕頭 515065)

社交挫敗應(yīng)激動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于抑郁癥等應(yīng)激相關(guān)精神疾病的研究[1]。既往研究顯示青春期或成年期社交挫敗小鼠前額葉皮層髓鞘含量減少[2-3]，動(dòng)物表現(xiàn)出社交回避及抑郁樣行為[4]。青春期及成年期NG2細(xì)胞不斷分化成熟，參與髓鞘的穩(wěn)態(tài)維持。這一過程也受到外界環(huán)境因素影響，目前認(rèn)為這可能是神經(jīng)可塑性的生物學(xué)基礎(chǔ)之一[5-6]。青春期小鼠經(jīng)歷社交剝奪后表現(xiàn)為工作記憶損害、社交退縮，這些行為改變與前額葉髓鞘及少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷相關(guān)[5]。這些研究提示青春期應(yīng)激經(jīng)歷可能導(dǎo)致前額葉白質(zhì)損傷及認(rèn)知功能障礙。然而，青春期社交挫敗應(yīng)激對少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞和髓鞘的發(fā)育，以及認(rèn)知功能的影響尚未深入探討。本研究探討青春期社交挫敗應(yīng)激對小鼠執(zhí)行功能、記憶以及少突膠質(zhì)細(xì)胞系/髓鞘相關(guān)病理的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡青春期雄性BALB/c小鼠34只，8～9月齡CD-1(ICR)小鼠，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證編號(hào)分別為 11400700178467 及 11400700178659)。BALB/c小鼠每籠4只飼養(yǎng)，CD-1小鼠單籠飼養(yǎng)，提供充足食物和水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境3 d。飼養(yǎng)房室溫保持在(23±2)℃，濕度維持在(50±5)%，保持12 h光照和12 h黑暗交替，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。本研究通過汕頭大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(倫理號(hào)SUMC2016-117)。

1.1.2 主要試劑與儀器 髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)購自美國Santa cruz公司，β-actin抗體購自中國新晉生物公司，BrdU抗體、NG2抗體、腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)抗體購自美國Chemicon公司、離子化鈣離子結(jié)合接頭分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)抗體購自日本W(wǎng)ako公司，皮質(zhì)酮酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自瑞士Enzo Life Sciences公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程 BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組和應(yīng)激組，每組17只。應(yīng)激組在產(chǎn)后第25～42天接受慢性間歇性社交挫敗應(yīng)激，應(yīng)激期間每3 d應(yīng)激后停止1 d，對照組不接受任何應(yīng)激。應(yīng)激結(jié)束后第1～3天進(jìn)行迷盒實(shí)驗(yàn)，于第4～5天麻醉后取血，腦組織用于ELISA、Western blot及免疫組化檢測。應(yīng)激結(jié)束后第1～4天下午16:30～18:00腹腔注射BrdU，劑量為100 mg/kg。

1.2.2 社交挫敗應(yīng)激 將BALB/c實(shí)驗(yàn)鼠置于CD-1小鼠籠中，接受軀體攻擊2 min，然后將BALB/c小鼠置于籠中與CD-1小鼠在軀體上隔離，但實(shí)驗(yàn)鼠仍能感受到CD-1攻擊鼠的氣味、目光和聲音，該過程持續(xù)30 min，最后將BALB/c實(shí)驗(yàn)鼠移回原籠內(nèi)。

1.2.3 迷盒實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于檢測嚙齒類動(dòng)物的認(rèn)知功能，實(shí)驗(yàn)方法參考Ben等[7]的報(bào)道。迷盒主要由明區(qū)及暗區(qū)(目標(biāo)區(qū))組成，利用嚙齒類動(dòng)物趨暗天性，在明區(qū)進(jìn)入暗區(qū)的通道中設(shè)置不同的障礙，改變進(jìn)入暗區(qū)的難易程度，通過檢測小鼠從實(shí)驗(yàn)開始到首次進(jìn)入暗區(qū)的時(shí)間(潛伏期)評估它的執(zhí)行功能、短期記憶及長期記憶。實(shí)驗(yàn)分3 d，3個(gè)測試/d，共進(jìn)行9個(gè)測試，記為第1天(T1、T2、T3)；第 2天(T4、T5、T6)；第 3天(T7、T8、T9)。迷盒實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置見表1。每組10只小鼠，將小鼠置于明區(qū)遠(yuǎn)離門的一端，讓其自由活動(dòng)，記錄其進(jìn)入暗區(qū)所用的時(shí)間。如果超過5 min仍未進(jìn)入暗區(qū)，則記錄時(shí)間為300 s。

表1 迷盒實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置

1.2.4 免疫組化 麻醉取腦后用多聚甲醛固定，蔗糖溶液脫水用于冰凍切片。切片加入NG2抗體(1∶200稀釋)，Iba1抗體(1∶1 000稀釋)，APC抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜，生物素化二抗室溫下孵育1 h，加入ABC混合液，磷酸鹽緩沖液清洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色，酒精脫水及二甲苯透明封片保存，顯微鏡下觀察。BrdU免疫組化檢測步驟：加入BrdU抗體，4℃孵育過夜，生物素化二抗室溫下孵育1 h，加二抗，封片固定，鏡下200倍分析。每只鼠在內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex，mPFC)區(qū) (bregma+1.98 mm～+1.54 mm)間隔150 μm取3張腦切片做定量分析，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)量/mm2表示。

1.2.5 Western blot 腦組織在RIPA裂解液中勻漿后離心10 min(13 400×g，4℃)取上清液。按BCA試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫孵育1.5 h后加入相應(yīng)一抗山羊抗MBP(1∶1 000稀釋)，鼠抗β-actin(1∶5 000稀釋)孵育過夜，然后分別加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影定影。

1.2.6 ELISA 小鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉至淺反射消失后，快速內(nèi)眥取血，室溫靜置1 h，800×g，4℃離心10 min后按照ELISA試劑盒檢測說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青春期慢性社交挫敗應(yīng)激損害小鼠短時(shí)記憶及長時(shí)記憶

在迷盒實(shí)驗(yàn)的T3及T4測試，應(yīng)激組首次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)的潛伏期比對照組延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在其他測試中，2組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。見表2。

表2 應(yīng)激組與對照組首次進(jìn)入目標(biāo)區(qū)的潛伏期比較 (s)

2.2 青春期慢性社交挫敗應(yīng)激降低mPFC腦區(qū)MBP的表達(dá)

在mPFC腦區(qū)，應(yīng)激組小鼠MBP蛋白的表達(dá)較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。應(yīng)激組小鼠海馬區(qū)MBP蛋白的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 應(yīng)激組與對照組MBP表達(dá)比較

2.3 青春期慢性社交挫敗應(yīng)激不改變mPFC腦區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞及增殖細(xì)胞數(shù)量

應(yīng)激組小鼠mPFC腦區(qū)OPC細(xì)胞(NG2陽性)、OL細(xì)胞(APC陽性)以及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量與對照組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 應(yīng)激組與對照組少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞及增殖細(xì)胞數(shù)量比較

2.4 青春期慢性社交挫敗應(yīng)激不影響mPFC腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

mPFC腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1陽性細(xì)胞)胞體較小，突起呈高度分枝狀，細(xì)胞均勻散在分布，應(yīng)激組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 應(yīng)激組與對照組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量比較

2.5 青春期慢性社交挫敗應(yīng)激對應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)的影響

應(yīng)激組小鼠應(yīng)激前體重和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。應(yīng)激結(jié)束后，應(yīng)激組小鼠體重低于對照組，腎上腺質(zhì)量高于對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.001)。而應(yīng)激組和對照組小鼠外周血皮質(zhì)酮含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 應(yīng)激組與對照組應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)比較 (n=17，±s)

表3 應(yīng)激組與對照組應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)比較 (n=17，±s)

組別對照組應(yīng)激組t值P值應(yīng)激前體重/g 13.61±0.62 12.73±1.49 1.452 0.185應(yīng)激后體重/g 22.90±0.45 17.56±1.15 11.414＜0.001腎上腺質(zhì)量/mg 5.29±1.60 9.29±1.50-4.86＜0.001皮質(zhì)酮含量/(μg/mL)12.34±3.95 17.38±9.97-1.033 0.345

3 討論

本研究顯示青春期小鼠在社交挫敗應(yīng)激后，mPFC腦區(qū)MBP表達(dá)下降，而在海馬區(qū)沒有改變，提示社交挫敗應(yīng)激降低前額葉MBP表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)青春期經(jīng)歷慢性社會(huì)隔離應(yīng)激的小鼠其前額葉MBP、髓鞘相關(guān)糖蛋白mRNA水平降低，髓鞘厚度變薄[5]，成年期慢性不可預(yù)見應(yīng)激[8-9]或社交挫敗應(yīng)激[10]降低前額葉皮層髓鞘相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。這些結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)一致，表明不同類型的慢性應(yīng)激均對前額葉髓鞘造成損害。Andersen等[11]臨床研究發(fā)現(xiàn)14～16歲青少年遭受性虐到后前額葉皮層灰質(zhì)減少，而海馬則幾乎沒有改變。這與本研究結(jié)果類似，表明青春期慢性應(yīng)激對前額葉髓鞘有特異性損害。

本研究發(fā)現(xiàn)慢性青春期社交挫敗應(yīng)激導(dǎo)致小鼠T3、T4測試時(shí)進(jìn)入靶區(qū)域的潛伏期延長，顯示存在短時(shí)及長時(shí)記憶損害。記憶功能受到海馬、mPFC等多個(gè)腦區(qū)調(diào)控，任何一個(gè)相關(guān)腦區(qū)損傷都可能導(dǎo)致記憶障礙，而本研究中mPFC區(qū)髓鞘損傷，海馬髓鞘沒有損傷，表明前額葉髓鞘損傷可能和記憶受損存在相關(guān)性。但尚需進(jìn)一步的干預(yù)研究探討兩者間的因果關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)前額葉MBP蛋白水平降低，OPC及OL數(shù)量無改變，BrdU細(xì)胞數(shù)量無改變。提示髓鞘MBP的降低不是由于OPC增殖及分化異常引起的。既往一些研究觀察了社交挫敗應(yīng)激對OPC及OL的影響，但研究結(jié)果并不一致。青春期社交隔離小鼠出現(xiàn)mPFC腦區(qū)MBP表達(dá)下降，但少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量沒有變化，這與少突膠質(zhì)細(xì)胞組蛋白乙?；统Ｈ旧|(zhì)增加有關(guān)[12]。臨床證據(jù)表明幼年逆境不影響少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，但減少了扣帶回皮層白質(zhì)中的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，這與少突膠質(zhì)細(xì)胞DNA甲基化降低有關(guān)[13]。以上說明髓鞘損傷可能通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控。但目前應(yīng)激對海馬的髓鞘機(jī)制研究還較缺乏。

本研究發(fā)現(xiàn)青春期社交挫敗應(yīng)激不影響前額葉小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)。但尚不能排除小膠質(zhì)細(xì)胞參與應(yīng)激所致的髓鞘損傷過程的可能。本研究采用Iba1檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)，尚需采用其他激活狀態(tài)標(biāo)志物進(jìn)一步地探討。應(yīng)激結(jié)束后第4天測量外周血皮質(zhì)酮水平，應(yīng)激組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明青春期慢性應(yīng)激不改變皮質(zhì)酮基礎(chǔ)水平。腎上腺在慢性應(yīng)激條件下分泌糖皮質(zhì)激素，在體外研究中發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致髓鞘長度變短及MBP減少[14]，在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對髓鞘形成有促進(jìn)[15]或抑制[16]作用，同時(shí)高劑量糖皮質(zhì)激素可降低髓鞘MBP的表達(dá)，而低劑量未抑制髓鞘MBP的表達(dá)[17]，這可能與髓鞘所處環(huán)境及糖皮質(zhì)激素劑量不同有關(guān)，因此糖皮質(zhì)激素高劑量毒性作用可能是mPFC腦區(qū)MBP表達(dá)降低的分子機(jī)制，我們計(jì)劃在未來的研究中探討這一可能性。

綜上所述，青春期慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致認(rèn)知功能損害及前額葉腦區(qū)髓鞘損傷，髓鞘損傷可能是認(rèn)知功能下降的生物學(xué)機(jī)制。應(yīng)激所致的髓鞘損傷可能涉及下丘腦—垂體—腎上腺軸激活及小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。