葛向平

（山東省膠州市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 膠州 266300）

兔多殺性巴氏桿菌病是由兔多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）引起的一種接觸性、急性傳染病，由于病原的感染部位不同而呈現(xiàn)敗血癥、傳染性鼻炎、地方流行性肺炎、子宮積膿、睪丸炎和膿腫等病癥。該病呈散發(fā)性、多形性或地方流行性[1-2]。一般無(wú)季節(jié)性，在氣溫驟變及多雨季節(jié)容易發(fā)病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一[3]。

1 發(fā)病情況

2020年10月，膠州一農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的20只3月齡兔，出現(xiàn)食欲廢絕、咳嗽、呼吸困難、打噴嚏、流鼻涕。發(fā)病兔腹瀉，排綠色稀便，眼結(jié)膜充血，個(gè)別兔出現(xiàn)四肢抽搐、歪頭等神經(jīng)癥狀，死亡5只，其它兔個(gè)別精神不振。

2 剖檢癥狀

剖檢死亡兔可見(jiàn)肺出血、氣管環(huán)出血，肝臟腫大，表面有灰黃色或灰白色壞死點(diǎn)，脾臟呈現(xiàn)暗紅色，表面有出血點(diǎn)，腸黏膜充血，有出血點(diǎn)。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 涂片檢查 無(wú)菌取發(fā)病兔肝臟、脾臟剪碎，制成涂片，經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)大小一致、兩端鈍圓的球桿狀或短桿狀革蘭氏陰性菌。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無(wú)菌取發(fā)病兔肝臟分別接種于含0.1 % 牛裂解血球全血及4 % 小牛血清的改良馬丁肉湯瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)麥康凱培養(yǎng)基中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，而在含0.1 % 牛裂解血球全血及4 % 小牛血清的改良馬丁肉湯瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落邊緣整齊，光滑、濕潤(rùn)、灰白色菌落。分離菌用革蘭氏染色后在顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，均符合巴氏桿菌培養(yǎng)特性。

3.3 生化鑒定 （1）糖發(fā)酵試驗(yàn)：取分離菌株接種糖發(fā)酵管培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后觀(guān)察結(jié)果，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖，不發(fā)酵乳糖。（2）吲哚試驗(yàn)：將分離菌株接種于色氨酸肉湯培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，滴加Kovacs靛基質(zhì)試劑2～3滴，立即觀(guān)察結(jié)果，反應(yīng)陽(yáng)性。（3）氧化酶試驗(yàn)：取一片氧化酶試紙，用一滴無(wú)菌水潤(rùn)濕試紙，用玻璃棒或一次性塑料接種環(huán)挑取分離菌株涂于紙片上，觀(guān)察1 min，呈陽(yáng)性反應(yīng)。

3.4 PCR鑒定 （1）引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)多殺性巴氏桿菌PCR鑒定引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為460bp，序列如下：F：5’-ATCCGCTATTTAC CCAGTGG-3’，R：5’-GCTGTAAACGAACTCG CCAC-3’。（2）PCR樣品處理：取分離菌加入含10μl雙蒸水的小離心管中，95 ℃ 加熱10 min，冰浴10 min后作為PCR擴(kuò)增模板，用雙蒸水作陰性對(duì)照。（3）PCR擴(kuò)增及電泳：反應(yīng)體系：模板 2 μl，10 × PCR Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mM dNTP 2 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶0.3 μl，然后加水至25 μl。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃ 復(fù)性1 min，72 ℃ 延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，轉(zhuǎn)入4 ℃ 終止反應(yīng)。經(jīng)1 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，被檢樣品出現(xiàn)460 bp大小的DNA帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶。

4 結(jié)論

通過(guò)臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該養(yǎng)殖戶(hù)病兔為巴氏桿菌感染，兔巴氏桿菌病是威脅養(yǎng)兔業(yè)的嚴(yán)重疫病，為避免該疫病的發(fā)生，應(yīng)及時(shí)做好防控工作，按時(shí)免疫，一旦發(fā)現(xiàn)疾病，立即采取措施，進(jìn)行治療與控制。