李 華 錢睿亞 李 蓉

目前，我國不孕不育患病人數(shù)已經(jīng)高達(dá)7000萬，育齡期夫婦的不孕不育發(fā)生率已升高至12%～15%[1]。正常血管生成在子宮內(nèi)膜種植窗的開啟和維持以及胚胎植入和發(fā)育過程中起著非常重要的作用，它可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫及蛻膜化發(fā)生[2]。參與子宮內(nèi)膜血管生成的細(xì)胞因子主要有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)及血管生成素(angiogenin，ANG)。其中VEGF對(duì)子宮內(nèi)膜血管生成起到關(guān)鍵作用，可極強(qiáng)地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，同時(shí)也具有增加血管通透性的作用。子宮內(nèi)膜VEGF在月經(jīng)周期中的變化規(guī)律和調(diào)控機(jī)制至今尚未完全闡明。既往有通過研究哺乳動(dòng)物子宮內(nèi)膜標(biāo)本和研究女性月經(jīng)周期血清中VEGF的變化推測(cè)其在人子宮內(nèi)膜的變化規(guī)律，但是結(jié)果存在爭(zhēng)議。本研究旨在探索人子宮內(nèi)膜VEGF在整個(gè)月經(jīng)周期的表達(dá)變化。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象及納入排除標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象：收集2014年1月～2019年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科及北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行子宮內(nèi)膜活檢或?qū)m腔鏡檢查的患者留取的子宮內(nèi)膜標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)月經(jīng)規(guī)律(22～34天)，因男方因素不孕、超聲監(jiān)測(cè)有排卵。(2)檢查前3個(gè)月未使用激素治療。(3)取得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)宮腔鏡下可見子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉、宮腔粘連、子宮縱隔等。(2)病理結(jié)果回報(bào)子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜增殖癥等。(3)除外其他生殖系統(tǒng)疾病如多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等。(4)除外內(nèi)科合并癥。

2.標(biāo)本收集及處理：對(duì)因B超提示子宮內(nèi)異常(如子宮內(nèi)膜回聲不均、宮腔積液、子宮內(nèi)膜息肉等)為宮腔鏡手術(shù)探查指征的患者，在行宮腔鏡檢查未探及宮腔異常后，使用一次性子宮內(nèi)膜吸管行子宮內(nèi)膜活檢；對(duì)無宮腔鏡探查指征但需行子宮內(nèi)膜活檢的患者直接采用一次性子宮內(nèi)膜吸管行內(nèi)膜活檢。子宮內(nèi)膜離體后立即用0.9%NaCl注射液沖洗干凈表面血液，一份放入10%甲醛溶液固定，常規(guī)送病理檢查；一份放入4%多聚甲醛溶液固定24h后用石蠟包埋，待行免疫組織化學(xué)染色；另一份置于5ml EP管中放于-80℃冰箱保存。宮腔鏡手術(shù)、子宮內(nèi)膜活檢由固定兩位醫(yī)生完成。標(biāo)本的收集、處理由另外1位醫(yī)生完成，以保證結(jié)果的可靠性。

3.分組情況：依據(jù)內(nèi)膜活檢的月經(jīng)周期時(shí)間收集月經(jīng)期、增殖早期、增殖中期、增殖晚期的子宮內(nèi)膜。對(duì)擬取分泌期子宮內(nèi)膜的患者在行宮腔鏡或子宮內(nèi)膜活檢的月經(jīng)周期由固定兩位醫(yī)生行超聲下卵泡監(jiān)測(cè)，確定有排卵。所有入組標(biāo)本均請(qǐng)兩位病理科醫(yī)生共同閱片。依據(jù)子宮內(nèi)膜活檢的月經(jīng)周期時(shí)間、超聲監(jiān)測(cè)排卵情況及顯微鏡下切片圖像特點(diǎn)，將子宮內(nèi)膜分為7組，即組1(月經(jīng)期)、組2(增殖早期)、組3(增殖中期)、組4(增殖晚期)、組5(分泌早期)、組6(分泌中期)和組7(分泌晚期)。

4.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果分析：將石蠟包埋組織做切片兩張，一張行免疫組織化學(xué)染色，另一張行HE染色。每張切片在顯微鏡相同放大倍數(shù)下(×40)觀察，采用佳能微成像系統(tǒng)在相同曝光時(shí)間、背景光源下隨機(jī)選取2個(gè)視野拍攝照片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析，測(cè)量每張切片的累積吸光度(A)值，對(duì)VEGF在子宮內(nèi)膜整體表達(dá)進(jìn)行分析。顯微鏡下著色顆粒為棕色定義為強(qiáng)陽性，黃色定義為陽性，淡黃色定義為弱陽性，未著色定義為陰性，對(duì)VEGF在子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的不同表達(dá)進(jìn)行定性分析。

改革不斷前行，形式不斷變化，然而數(shù)學(xué)課堂始終應(yīng)是思維主導(dǎo)的課堂．筆者從“直線與圓的位置關(guān)系”復(fù)習(xí)課中進(jìn)一步體會(huì)到“為思維而教”的真正含義和做法，如鯁在喉不吐不快，特梳理成文，就教于同行．

增殖早期、增殖中期、分泌中期、分泌晚期子宮內(nèi)膜VEGF mRNA表達(dá)相近。

為了協(xié)調(diào)區(qū)域發(fā)展中的不平衡以及推動(dòng)跨區(qū)域合作，為其提供理論參考與支持，在實(shí)踐中政府部門必須要深化區(qū)域旅游合作，基于旅游資源構(gòu)建區(qū)域，制定政策方針，充分發(fā)揮中心城市自身的輻射帶動(dòng)作用，通過跨地區(qū)合作等方式，實(shí)現(xiàn)最大空間效應(yīng)，構(gòu)建利益共同體，推動(dòng)城市旅游行業(yè)的協(xié)調(diào)發(fā)展。

VEGF是子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成和毛細(xì)血管通透性增加的主要調(diào)節(jié)因子[3]。cDNA序列研究表明VEGF存在著5種異構(gòu)體，分別是VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206[4]。子宮內(nèi)膜中VEGF來源于腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]。此外，內(nèi)膜組織中的巨噬細(xì)胞、間質(zhì)中一些侵入的炎性細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞也可以分泌VEGF[6]。VEGF有兩種主要受體，分別是VEGFR1和VEGFR2，主要分布于血管內(nèi)皮及腺上皮細(xì)胞[4]。女性月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明，大部分研究顯示其主要受缺氧和卵巢分泌的甾體激素調(diào)控。月經(jīng)期內(nèi)膜剝脫造成的缺氧刺激內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生VEGF。在增殖期，逐漸升高的雌二醇(estrodiol，E2)作用于內(nèi)膜間質(zhì)及上皮細(xì)胞的雌激素受體，誘導(dǎo)VEGF的分泌進(jìn)一步增加。進(jìn)入分泌期，孕激素(progesterone，P)通過抑制雌激素受體，減輕雌激素對(duì)VEGF的作用[4]。此外，子宮內(nèi)膜微環(huán)境中的一些細(xì)胞因子，如FGF、EGF等也可以通過自分泌和旁分泌的方式對(duì)VEGF的表達(dá)產(chǎn)生影響[5,6]。

1.入組情況：研究共入組113個(gè)標(biāo)本，其中月經(jīng)期標(biāo)本20個(gè)，增殖早期15個(gè)，增殖中期16個(gè)，增殖晚期17個(gè)，分泌早期15個(gè)，分泌中期14個(gè)，分泌晚期16個(gè)?；颊吣挲g為23～38歲，月經(jīng)周期24～34天，各組平均年齡、月經(jīng)周期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表1。

結(jié) 果

3.子宮內(nèi)膜VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量：不同分組子宮內(nèi)膜VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量詳見圖2。增殖晚期子宮內(nèi)膜VEGF mRNA表達(dá)顯著增加，與各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而月經(jīng)期及分泌早期子宮內(nèi)膜VEGF mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)。

表1 不同組間子宮內(nèi)膜A值及平均年齡、月經(jīng)周期

2.圖像分析結(jié)果：月經(jīng)期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)最低，增殖早期、增殖中期表達(dá)增強(qiáng)，至增殖晚期表達(dá)最強(qiáng)，與其他各個(gè)時(shí)期的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。分泌早期開始，VEGF的表達(dá)下降，較增殖晚期下降顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。到分泌中、晚期，VEGF表達(dá)再次升高。在月經(jīng)周期中，月經(jīng)期及分泌早期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)最低(P<0.05)，增殖晚期VEGF表達(dá)最大(P<0.05)，詳見表1、圖1。

圖1 不同組間子宮內(nèi)膜A值組4與各組比較，*P<0.05；組1與組5比較，P=0.10；組1和組5與其余各組比較，P<0.05

以瑞士洛桑酒店管理學(xué)院為代表的歐洲酒店管理專業(yè)教育一般采用的是“店中校，校中店”模式，即沒有專門的實(shí)訓(xùn)基地，學(xué)校就是酒店、工作場(chǎng)所就是實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所和教室、部門就是課程載體、經(jīng)理就是老師、學(xué)生就是員工，這種多重融合的形式，使酒店運(yùn)營與課程講授一體、員工操作與學(xué)生實(shí)踐一體、經(jīng)理管理與教師傳授一體，酒店和學(xué)校實(shí)現(xiàn)無縫隙全方位融合。

則T?V關(guān)于定義的運(yùn)算構(gòu)成保積Hom-Jordan李代數(shù)當(dāng)且僅當(dāng)ω為2-上圈,且α°ρA([x,y])=ρA(x)°ρA(α(y))-δ ρA(y)°ρA(α(x))。

圖2 不同組間子宮內(nèi)膜VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量增殖晚期與各組比較，*P<0.05；月經(jīng)期、分泌早期與其余各組比較，*P<0.05

5.RT-PCR技術(shù)分析子宮內(nèi)膜VEGF mRNA表達(dá)：-80℃冰箱中取出子宮內(nèi)膜組織，復(fù)溶后充分研磨，TRIzol法提取組織總RNA。取2μl總RNA利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量，合格樣本按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，后進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。VEGF以GAPDH為內(nèi)參基因，在Genbank上查找目的基因mRNA序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程有限公司合成兩對(duì)引物：GAPDH引物上游序列：5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游序列：5′-GGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′，目的片段長度為112bp；VEGF引物上游序列：5′-GAGGGCAGAATCATCACG-3′，下游序列： 5′-TCCAGGGCATTAGACACC-3′，目的基因片段長度為432bp。VEGF的擴(kuò)增條件為：94℃變性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。

4.免疫組化結(jié)果：顯微鏡下可以觀察到VEGF表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞、間質(zhì)及血管內(nèi)皮細(xì)胞，表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。VEGF在整個(gè)月經(jīng)周期中都有表達(dá)，但是表達(dá)強(qiáng)度在各個(gè)時(shí)期有所不同：在月經(jīng)期VEGF的表達(dá)呈弱陽性；進(jìn)入增殖期后，內(nèi)膜及間質(zhì)都有強(qiáng)陽性的染色，增殖晚期著色明顯較深；分泌早期染色減弱，以弱陽性染色為主，分泌中、晚期又開始出現(xiàn)強(qiáng)陽性。此外，VEGF在同一時(shí)期的內(nèi)膜腺體與間質(zhì)表達(dá)也略有差異：在月經(jīng)期VEGF主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞；在增殖期及分泌早期，同一切片的子宮內(nèi)膜腺體染色較間質(zhì)深；在分泌中、晚期，間質(zhì)染色較腺體深。對(duì)于內(nèi)膜腺體來說，整個(gè)增殖其及分泌早期為強(qiáng)陽性染色，分泌中期及晚期為弱陽性染色。對(duì)于內(nèi)膜間質(zhì)來說，月經(jīng)期為弱陽性染色，增殖早、中期為陽性染色，增殖晚期為強(qiáng)陽性染色，分泌早期為陽性染色，分泌中、晚期為強(qiáng)陽性染色(圖3)。

圖3 月經(jīng)不同時(shí)期VEGF的表達(dá)(HE染色，×100)g.腺體；s.間質(zhì)；b.血管；A.VEGF表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)、血管上皮細(xì)胞；B.月經(jīng)期(M2)內(nèi)膜，VEGF在間質(zhì)染色弱陽性；C.增生早期(M6)子宮內(nèi)膜，VEGF染色加深，部分腺體染色強(qiáng)陽性；D.增生中期(M10)子宮內(nèi)膜，部分腺體染色強(qiáng)陽性，腺體染色較間質(zhì)深；E.增殖晚期(M15)子宮內(nèi)膜：腺體及間質(zhì)染色均有強(qiáng)陽性染色；F.分泌早期(M16)子宮內(nèi)膜：VEGF表達(dá)開始降低；G.分泌中期子宮內(nèi)膜(M22)：染色加強(qiáng)，VEGF在間質(zhì)表達(dá)較腺體強(qiáng)；H.分泌晚期(M27)子宮內(nèi)膜：間質(zhì)染色增強(qiáng)

討 論

6.主要試劑：VEGF為兔抗人1∶200，二抗為二步法通用山羊抗兔抗體，顯色劑為DAB，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TRIzol試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Gibco/BRL公司。DNA聚合酶、內(nèi)參GAPDH及VEGF引物購自上海生物工程有限公司。

本研究結(jié)果顯示，增殖期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)增加，到增殖晚期達(dá)到最大，這和月經(jīng)周期中的E2水平變化一致。分泌早期開始后VEGF表達(dá)顯著下降，可能與下降的E2水平有關(guān)。但在分泌期中期，VEGF表達(dá)再次升高，特別是內(nèi)膜間質(zhì)VEGF表達(dá)增強(qiáng)，這說明在此時(shí)期，VEGF的表達(dá)不只受E2、P的影響，其他因素如內(nèi)膜間質(zhì)中增加的細(xì)胞因子的調(diào)控可能也發(fā)揮了重要作用。

我國氣電裝機(jī)以5大發(fā)電集團(tuán)為主，其氣電發(fā)電量占全國的50%，其中華電集團(tuán)、華能集團(tuán)氣電裝機(jī)規(guī)模較大，2017年分別達(dá)到1432萬千瓦和1042萬千瓦。中國海油依托上游天然氣產(chǎn)業(yè)的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)建設(shè)了較多氣電項(xiàng)目，裝機(jī)總量達(dá)到846萬千瓦。另外，京能、深能源、浙能和粵電等地方發(fā)電企業(yè)的氣電裝機(jī)總量也分別達(dá)到478、318、236和234萬千瓦。國電、神華合并后，氣電裝機(jī)總量達(dá)到199萬千瓦（見圖3）。

關(guān)于子宮內(nèi)膜VEGF的月經(jīng)周期表達(dá)變化規(guī)律，既往研究結(jié)果存在很大爭(zhēng)議，但是結(jié)果都顯示其表達(dá)呈周期性變化。有研究將獼猴的子宮內(nèi)膜作為研究對(duì)象，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜間質(zhì)VEGF在增殖中期達(dá)到高峰，內(nèi)膜腺體VEGF在分泌晚期表達(dá)最強(qiáng)[7]。Licht等[8]研究了54例不孕女性分泌期的子宮內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)分泌晚期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)最大，VEGF與子宮蛻膜化發(fā)生密切相關(guān)。另有研究53例健康女性不同時(shí)期血清VEGF水平，發(fā)現(xiàn)其在排卵前達(dá)到高峰，此后略有下降，但分泌期仍維持在較高水平，這與本研究結(jié)果相似[9]。在月經(jīng)周期中，增殖期是子宮內(nèi)膜血管最密集的生成階段，本研究結(jié)果也提示增殖晚期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)達(dá)到最大。增殖期VEGF表達(dá)的逐漸增加促進(jìn)了子宮內(nèi)膜血管的生成，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜的恢復(fù)、生長和向分泌期轉(zhuǎn)化，為隨后種植窗期胚胎的植入和發(fā)育提供必備條件。

子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity，ER)是指子宮內(nèi)膜接納胚胎植入的一種綜合狀態(tài)，包括子宮內(nèi)膜豐富的血供和子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮及間質(zhì)的充分發(fā)育，它開啟的時(shí)間是短暫的，僅在分泌中期的一小段時(shí)間[10]。ER的出現(xiàn)是諸多因素共同調(diào)控的結(jié)果，至今尚未完全闡明。在胚胎植入過程中，血管生成起到重要作用，因此，作為子宮內(nèi)膜血管周期性生成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，VEGF在ER調(diào)控過程中的作用也越來越被重視。近期研究表明，早期妊娠丟失和胚胎種植失敗與子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)下降有關(guān)。馮苗等[11]研究對(duì)比了IVF-ET失敗患者和正常已育女性種植窗期的子宮內(nèi)膜微血管密度與VEGF之間的差異，發(fā)現(xiàn)前者其內(nèi)膜微血管密度與VEGF表達(dá)均低于正常女性，提示著床窗期內(nèi)膜血管生成不良,可能是導(dǎo)致著床失敗的原因之一。Sadekova等[12]研究對(duì)比了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常已育女性分泌期子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜VEGF較正常女性顯著降低，且兩組中黃體功能不全的患者其子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)更進(jìn)一步降低，提示子宮內(nèi)膜血管生成異常，可能是黃體期子宮內(nèi)膜發(fā)育不成熟從而導(dǎo)致胚胎植入失敗的原因。

本研究結(jié)果顯示，月經(jīng)期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)較低，進(jìn)入增殖期后VEGF表達(dá)開始增強(qiáng)，增殖晚期達(dá)到高峰。增殖早、中期的VEGF通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成，促進(jìn)月經(jīng)過后子宮內(nèi)膜的修復(fù)和增殖。增殖晚期較高的VEGF水平，有利于其作用于內(nèi)皮下的血管網(wǎng)，引起微血管進(jìn)一步增殖和通透性增加，促進(jìn)血漿自微血管流入到細(xì)胞間質(zhì)，為隨后ER的出現(xiàn)提供條件[13]。進(jìn)入分泌期，VEGF在短暫下降后在中、晚期的表達(dá)再次上升，維持在較高水平，且內(nèi)膜間質(zhì)VEGF的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，提示VEGF可能在此時(shí)與子宮內(nèi)膜微環(huán)境中的細(xì)胞因子互相作用，進(jìn)而參與ER的構(gòu)建，對(duì)胚胎的植入及內(nèi)膜蛻膜化的發(fā)生產(chǎn)生影響[14]。

審計(jì)訴訟是會(huì)計(jì)師事務(wù)所面臨的巨大威脅，一旦出現(xiàn)審計(jì)訴訟，事務(wù)所的客戶就會(huì)流失，聲譽(yù)受損。所以為了減少審計(jì)訴訟的可能性，事務(wù)所就會(huì)想盡一切辦法地提高審計(jì)質(zhì)量。

近年來輔助生育技術(shù)在不斷發(fā)展，但其臨床妊娠率與持續(xù)妊娠率都分別只有44%和41%[15，16]。雌孕激素與局部細(xì)胞因子對(duì)VEGF的調(diào)控與子宮內(nèi)膜容受性的出現(xiàn)及胚胎的植入密切相關(guān)，這為在臨床治療中，尋找評(píng)估及改善子宮內(nèi)膜容受性、提高妊娠率的方法提供了新思路。既往研究多關(guān)注子宮內(nèi)膜厚度和分型與ER的關(guān)系，近年來多項(xiàng)研究認(rèn)為子宮內(nèi)膜血流也與ER密切相關(guān)。子宮內(nèi)膜血流豐富者，其胚胎種植率及臨床妊娠率高，用彩色超聲多普勒能量圖記錄子宮內(nèi)膜血流可以更好地評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性，對(duì)體外受精胚胎移植妊娠結(jié)局有更好的預(yù)測(cè)作用[17]。Yu等[18]研究顯示，使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行宮腔灌注治療后可提高著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性。此外，通過使用芬嗎通、低分子肝素、低劑量阿司匹林和西地那非等方法，也可以增加子宮內(nèi)膜血流、提高臨床妊娠率[19]。

綜上所述，子宮內(nèi)膜VEGF在月經(jīng)周期呈周期性變化，增殖晚期表達(dá)最強(qiáng)，月經(jīng)期及分泌早期表達(dá)最低，增殖早、中期及分泌物中、晚期處于較高水平。未來需進(jìn)一步探索VEGF表達(dá)的調(diào)控因素，為探索評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性新指標(biāo)及提高不孕癥患者臨床妊娠率的方法提供新思路。