劉巧遇 李若坤

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)病率和致死率高[1]。血管生成是肝癌的標(biāo)志，為肝癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)?？寡苌墒侵委煾伟┲匾侄沃?，以索拉非尼為代表的多種抗肝癌血管生成藥物已應(yīng)用于臨床[2]。為評估抗血管生成治療效果，需對腫瘤功能血管進(jìn)行可視化和定量表征。組織病理學(xué)等常規(guī)方法只能展示腫瘤血管的二維結(jié)構(gòu)[3]，無法對血管分支、長度或卷曲度等進(jìn)行全體積評估，因此，需尋求能更準(zhǔn)確定量肝癌血管特征的有效方法。小動物成像Micro-CT具有高的空間分辨率，可對復(fù)雜血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行立體成像和結(jié)構(gòu)定量分析，全面展示血管三維結(jié)構(gòu)特征并完整評估腫瘤血管樹[4]。

本研究建立肝癌裸鼠原位移植瘤模型，利用Micro-CT聯(lián)合定量分析量化腫瘤血管三維結(jié)構(gòu)特征，從不同的角度展示肝癌血管生成特點，為進(jìn)一步明確抑制腫瘤血液供應(yīng)的潛在途徑提供新的思路。

資料與方法

一、實驗動物

SPF級Balb/c裸小鼠，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，共20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗操作與飼養(yǎng)嚴(yán)格無菌。

二、實驗方法

(一)原位肝癌動物模型建立 裸鼠隨機(jī)分為肝癌組(n=10)和正常對照組(n=10)。肝癌組采用MHCC97H人肝癌細(xì)胞株進(jìn)行建模。首先于裸鼠左側(cè)腋窩建立皮下移植瘤，4周后無菌條件下取出腫瘤，去除壞死組織，修剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤塊，移植入裸鼠肝表面，縫合肝包膜和皮膚，于無菌動物房內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)[5]。正常對照組于肝臟內(nèi)注射同等量0.9%氯化鈉溶液。操作結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)21 d。

(二)Micro-CT血管成像 (1)血管鑄型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.01 mL/g)麻醉裸鼠，隨后注射3 mL肝素鈉溶液(1250 U/mL)，將裸鼠仰臥位固定于固定板上，做胸腹長縱形切口，剪破橫膈，暴露腫瘤、心臟及升主動脈根部，絲線結(jié)扎左、右上腔靜脈及下腔靜脈近心端，左心室做小切口，將26G留置針軟管經(jīng)左心室插管至升主動脈口，確認(rèn)插管及灌注流速滿意后絲線固定導(dǎo)管，離斷下腔靜脈遠(yuǎn)心端，經(jīng)導(dǎo)管灌注肝素鈉生理鹽水20 mL(50 U/mL)，速率2 mL/min，經(jīng)下腔靜脈切口引流，可見肝臟由紅褐色轉(zhuǎn)為淺黃色，操作結(jié)束后再以4%甲醛5 mL進(jìn)行血管內(nèi)灌注固定。新鮮配置Microfli血管造影劑(美國Flow Tech公司)，容量5.6 mL，注射速率0.5 ml/min，經(jīng)導(dǎo)管灌注至肝臟及腫瘤表面微血管造影劑充填呈小樹枝狀。操作結(jié)束后將標(biāo)本置于4 ℃冰箱冷藏12 h后剝離裸鼠肝臟。(2)Micro-CT掃描：采用Quamtum GX Micro-CT。將肝臟鑄型標(biāo)本固定于掃描架上，進(jìn)行360度環(huán)形掃描。掃描參數(shù)如下：管電壓 90 KV；管電流 88 mA；FOV 36 mm×25 mm；空間分辨率50 μm；掃描時間 14 min；成像矩陣：512512。

(三)圖像分析 (1)腫瘤分割：采用最大密度投影(MIP)、容積再現(xiàn)技術(shù)(VR)重建血管圖像。利用mricron軟件(v4.0)對Micro-CT獲得的圖像進(jìn)行分割，于橫斷面上逐層勾畫腫瘤邊緣，利用mevislab軟件(v3.3)分割腫瘤與背景肝臟，獲得單獨的腫瘤影像。(2)血管分割：使用閾值法和區(qū)域生長法分割出血管結(jié)構(gòu)。利用影像的灰度直方圖，將閾值設(shè)置為4600(±50)用于區(qū)別血管與背景，閾值設(shè)置為3500(±100)用于區(qū)別肝臟組織與背景。閾值處理后，使用26-鄰域區(qū)域生長法獲取連通的血管結(jié)構(gòu)和肝組織結(jié)構(gòu)。(3)血管中心線提?。涸诜指罱Y(jié)果的基礎(chǔ)上，使用Matlab(R2019a)實現(xiàn)算法[5]。(4)網(wǎng)絡(luò)化：通過計算中心線上各個點之間的鄰接關(guān)系，將三維空間上的點映射到二維鄰接圖(graph)上。(5)量化特征計算：①血管計數(shù)類特征：統(tǒng)計血管與組織在影像上的體素個數(shù)，可得血管體積與組織體積，血管占比即為血管體積與組織體積之比。利用中心線圖進(jìn)行搜索可得血管分支數(shù)及分支長度，這些計數(shù)與組織體積的比值可得血管結(jié)構(gòu)的血管分支密度；②血管形態(tài)類特征：為了定量血管局部形態(tài)變化，計算血管彎曲度特征 Distance Factor (DF)和Sum of angles metric (SOAM)。DF可直觀的反映血管的彎曲程度，DF值越大，該血管分支的彎曲程度越大。Bullitt等[6]首次提出了SOAM方法來定量三維血管的彎曲程度，SOAM能從局部出發(fā)，反映血管的彎曲程度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。比較肝癌與正常肝臟血管的定量參數(shù)差異，符合正態(tài)性的參數(shù)選用兩獨立樣本t檢驗，否則采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血管三維結(jié)構(gòu)

20只裸鼠均完成建模，1只正常對照組裸鼠灌注失敗，共有10只肝癌組和9只對照組裸鼠完成實驗研究。

結(jié)果顯示，正常肝臟血管呈小樹枝狀分叉，分布均勻，走行自然。腫瘤組織血管分布雜亂無章，形態(tài)無規(guī)則，部分為不規(guī)則的囊狀擴(kuò)張，部分為樹枝狀分支，部分血管異常彎曲，腫瘤血管呈團(tuán)、呈簇形成復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。腫瘤周圍可見豐富、扭曲的血管包繞腫瘤，并由外向內(nèi)滲透性生長，腫瘤內(nèi)部血管較稀疏，可見大片狀無血管壞死區(qū)。以上結(jié)果表明，Micro-CT血管成像可以實現(xiàn)血管三維可視化，直觀顯示肝癌、正常肝臟血管三維形態(tài)特征(圖1，2)。

圖1 MHCC97H肝癌腫瘤Micro-CT成像二維圖 A：肝癌Micro-G圖像橫斷面；B：肝癌Micro-CT圖像冠狀面

圖2 三維重建圖像 A為MHCC97H肝癌原位移植瘤三維重建圖像； B為經(jīng)分割去除肝臟組織后腫瘤的血管三維重建圖像； C為正常肝臟血管三維重建圖像

二、血管定量參數(shù)

與健康肝臟血管相比，肝癌的血管占比、血管分支密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與健康肝臟血管相比，肝癌血管的平均半徑縮小、平均SOAM增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明肝癌內(nèi)部多為細(xì)小、扭曲的血管；肝癌血管的平均血管分支長度略小于健康肝臟，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。見表1。

討 論

本研究基于Micro-CT成像揭示了肝癌裸鼠原位移植瘤血管的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)，并從密度和形態(tài)兩方面描述了血管特征。肝癌血管結(jié)構(gòu)在大體形態(tài)和定量特征參數(shù)上均表現(xiàn)出與正常肝臟的明顯異質(zhì)性。正常肝臟血管分布均勻、走行自然，而肝癌血管結(jié)構(gòu)混亂。腫瘤的血管生成進(jìn)展十分復(fù)雜：在早期，血管密實而豐富，隨著腫瘤體積增加，其內(nèi)部出現(xiàn)缺血性壞死，在圖像中表現(xiàn)為沒有造影劑的灌注，這導(dǎo)致血管體積比例相對較低。文獻(xiàn)報道，與生長緩慢的腫瘤相比，生長迅速的腫瘤血管更細(xì)小，血管分支的總數(shù)更低[7]，與本研究中肝癌血管分支密度的降低一致。研究表明，由于腫瘤血管直徑小于健康組織，血管直徑可用于區(qū)分健康組織和腫瘤組織[8]。三維圖像顯示肝癌血管較正常肝臟血管扭曲，用平均DF、平均SOAM兩個形態(tài)學(xué)參數(shù)來定量血管的曲折度，將抽象的圖像信息轉(zhuǎn)化為具體的特征數(shù)據(jù)。腫瘤組織的曲折度更大，可用于識別良性和惡性腫瘤[6]，本研究結(jié)果也通過平均DF和SOAM得出一致的結(jié)論。

Micro-CT是一種非破壞性的3D成像技術(shù)，以超高的空間分辨率可視化血管的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)，具有易于準(zhǔn)備，成本低及血管形態(tài)表征等優(yōu)勢，在大鼠肺血管的Micro-CT所顯示的血管直徑最高分辨率為12.5 μm，臨床常用的血管成像技術(shù)如CTA、MRA等均不能顯示類似直徑的血管[9-11]。血管定量分析是以量化的數(shù)據(jù)來描述抽象的血管病變程度。Micro-CT聯(lián)合血管鑄型重建組織血管結(jié)構(gòu)，結(jié)合血管定量分析方法量化血管特征是近幾年的研究熱點，廣泛應(yīng)用于肺血管、腎臟疾病、肝血管及肝纖維化等各個組織及系統(tǒng)[12]。Debbaut等[13]對利用血管腐蝕鑄型方法和Micro-CT對人肝臟血管進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，可顯示肝血管樹的13級分支，肝血管的半徑從13.8 mm到80 μm不等，血管長度從74.4 mm到0.74 mm不等。

此外，采用人肝癌細(xì)胞系建立的裸鼠肝原位移植瘤模型可以很好地模擬人肝癌的解剖學(xué)特征。在定量分析中選擇整個腫瘤區(qū)域作為ROI，避免了因區(qū)域選擇不充分而導(dǎo)致的錯誤，相比免疫組織化學(xué)方法獲得了更準(zhǔn)確的結(jié)果。

表1 小鼠正常肝臟和肝癌的血管定量參數(shù)對比結(jié)果(±s)

本研究也有一些局限性。首先，手動劃定腫瘤邊界的瘤體提取方法有待進(jìn)一步優(yōu)化；其次，腫瘤中的一些血管可能未連接到中心血管樹，從而導(dǎo)致灌注過程中的填充不足；最后，實驗的樣本量較小。

基于Micro-CT成像，該研究展示了肝癌原位移植瘤血管的三維結(jié)構(gòu)，通過量化肝癌和健康肝臟的血管特征差異，可以進(jìn)一步明確抑制腫瘤血液供應(yīng)的潛在途徑。