鄧林華 趙俸涌 李 勤 黃 山魏 明 張亞輝 王承東 李德生* 朱自嚴(yán)*

(1.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，都江堰，611830；2.上海市血液中心，上海，200051)

血液作為機(jī)體氣體及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要結(jié)締組織，其生理生化的改變與生命體活動(dòng)息息相關(guān)，紅細(xì)胞作為氣體運(yùn)輸?shù)奈ㄒ惠d體，直接決定著生命體的氣體代謝。熊科(Ursidae)動(dòng)物分布較廣，部分種具有冬眠的生活特性，導(dǎo)致紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)生理生化亦發(fā)生改變以適應(yīng)生命體活動(dòng)，如冬眠中的棕熊(Ursusarctos)，紅細(xì)胞抗氧化物質(zhì)積累以抵抗其低代謝情況下有害物質(zhì)的積聚，從而保護(hù)紅細(xì)胞的生存[1]。

成熟的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞無(wú)核，其僅可通過(guò)無(wú)氧酵解途徑供能，而糖酵解依賴(lài)的豐富酶系一般通過(guò)與骨架蛋白互作而定位于紅細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)[2-3]，其氣體代謝功能行使所依賴(lài)的多種通道蛋白一般以多次穿膜的跨膜蛋白形式存在[4-5]，故紅細(xì)胞氣體代謝功能主要是以膜蛋白為基礎(chǔ)，這一點(diǎn)在其他哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞膜研究中已被充分證實(shí)，同時(shí)在一些生活習(xí)性特化的哺乳動(dòng)物中，膜蛋白數(shù)量也發(fā)生變化以適應(yīng)生命活動(dòng)需要，如駱駝科(Camelidae)動(dòng)物紅細(xì)胞為橢球型，帶3蛋白大量表達(dá)以適應(yīng)其血液滲透壓的變化[6]。

紅細(xì)胞膜蛋白研究早期以蛋白電泳為主，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)發(fā)展，目前較為全面地對(duì)紅細(xì)胞膜蛋白開(kāi)展的研究一般采用質(zhì)譜技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)按照對(duì)待測(cè)樣品添加電荷的不同而分為若干技術(shù)，但這些技術(shù)的共通之處是對(duì)蛋白質(zhì)酶解后的多肽片段進(jìn)行電荷標(biāo)記，通過(guò)質(zhì)量/電荷的數(shù)值(質(zhì)荷比M/Z)對(duì)該多肽片段進(jìn)行分離，分離后的帶電多肽片段通過(guò)電場(chǎng)磁場(chǎng)的篩選，最后通過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)。由于蛋白質(zhì)被酶解后形成的肽指紋圖譜是唯一的，故當(dāng)檢出多肽片段通過(guò)打分超過(guò)閾值后，就可以認(rèn)定該蛋白的存在。正由于以上原因?qū)е沦|(zhì)譜技術(shù)可同時(shí)處理較大量樣本信息，故對(duì)于未知蛋白樣品的分析十分有用[7-9]。本研究基于探索大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)紅細(xì)胞膜蛋白組學(xué)，通過(guò)液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)，對(duì)大熊貓及亞洲黑熊(Ursusthibetanus)紅細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液樣本來(lái)源及抗凝方法

本實(shí)驗(yàn)使用的大熊貓及亞洲黑熊血液來(lái)自于中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，血液樣本為4—10月采集(本實(shí)驗(yàn)中涉及大熊貓樣本為成年健康雄性，采樣年齡10歲；亞洲黑熊為成年健康雄性，年齡8歲)，血液采用EDTA·2K抗凝，采集血樣4℃運(yùn)輸，12 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人類(lèi)及C57BL6小鼠紅細(xì)胞樣本為檢驗(yàn)合格后的實(shí)驗(yàn)廢樣。

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：1 moL/LTris-HCl母液(上海生工生物B548142)，20×PBS母液(上海生工生物B548117)，Hoechst33342染料(B-2261，Sigma)。

主要儀器：離心機(jī)(Beckman-optima)，蛋白電泳儀(BIO-RAD)，分選流式細(xì)胞儀(Aria sorp，BD)質(zhì)譜儀TripleTOF5600系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧Ⅲ離子源(AB SCIEX)。

1.2 方法

1.2.1 血液分離

大熊貓抗凝血樣經(jīng)自然沉降后，使用移液器移去白膜層后，吸棄血漿，將剩余壓積紅細(xì)胞1∶50稀釋于1×PBS中。

1.2.2 紅細(xì)胞分選

將Hoechst33342染料配置成5 000 μg/mL母液，按照1 μL/1 mL比例加入上步制備紅懸液中，冰浴孵育30 min。流式分選儀提前30 min預(yù)熱，通過(guò)SSC與FSC參數(shù)，設(shè)門(mén)去除細(xì)胞碎片，血小板及黏連細(xì)胞；然后通過(guò)Hoechst33342染料熒光設(shè)門(mén)，去除有核細(xì)胞；最后將單個(gè)完整紅細(xì)胞分選至無(wú)菌15 mL離心管中。取500 μL分選后細(xì)胞懸液，離心后，去除400 μL上清，輕柔重懸細(xì)胞后，制片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞膜蛋白制備

將分選后的紅細(xì)胞3 500 rpm，離心5 min，小心移除上清，加入40倍體積的低滲液(0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)，充分混勻，冰浴30 min，4℃，40 000 rpm，離心20 min，沉淀用低滲溶液洗3次。將大熊貓紅細(xì)胞血影中加入200 μL RIPA裂解液，震蕩混勻，冰上放置30 min，5 000 rpm，離心5 min，上清即為可溶性膜蛋白溶液。

1.2.4 膜蛋白質(zhì)譜檢測(cè)

將蛋白樣品測(cè)定濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將凝膠進(jìn)行切膠回收、蛋白質(zhì)再溶解、蛋白質(zhì)樣本純化、脫鹽及加基質(zhì)后，進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。色譜分離采用2 μL/min的流速上樣。質(zhì)譜噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓為30 PSI，霧化氣壓為5 PSI，加熱器溫度為150℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴(lài)的采集工作模式。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Mascot 2.3軟件(Matrix Science)對(duì)質(zhì)譜結(jié)果原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，消化酶選擇胰蛋白酶，允許最大漏切位點(diǎn)為2；固定修飾為：Carbamidomethyl(C)；可變修飾為：Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)、Oxidation(M)、Phospho(ST)和Phospho(Y)；MS容差為±15 ppm，MSMS容差為±0.15 Da，Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大熊貓、亞洲黑熊流式分選純化

大熊貓紅細(xì)胞懸液樣本染色后，根據(jù)血細(xì)胞特性，使用SSC和FSC參數(shù)差異去除掉細(xì)胞碎片，血小板及黏連細(xì)胞，使用Hoechst染料去除掉有核細(xì)胞，獲得高純度大熊貓紅細(xì)胞，并對(duì)分選后細(xì)胞懸液濃縮后制片觀察進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如下(圖1)。

2.2 大熊貓、亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白電泳檢測(cè)

大熊貓與亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE分析，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，條帶上大熊貓、亞洲黑熊與人類(lèi)分布差不多，小鼠明顯少于三者。

2.3 大熊貓、亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)譜檢測(cè)

通過(guò)Blast2GO軟件對(duì)大熊貓及亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜原始結(jié)果注釋?zhuān)沧⑨尨笮茇埧扇苄约t細(xì)胞膜蛋白388種，在亞洲黑熊中共注釋出315種紅細(xì)胞膜蛋白。大熊貓與亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白在細(xì)胞上的定位主要在于膜部分、胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)及蛋白復(fù)合體，大熊貓紅細(xì)胞膜蛋白和亞洲黑熊膜蛋白在細(xì)胞上的定位位置基本相同。大熊貓和亞洲黑熊膜蛋白發(fā)揮催化功能的蛋白從種類(lèi)上分析差不多，主要有水解酶、轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶和裂解酶；數(shù)量上，大熊貓紅細(xì)胞所含各類(lèi)酶組分較亞洲黑熊豐富。結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)這些酶類(lèi)進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn)，大熊貓較亞洲黑熊在糖酵解及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白及酶系有諸多特有蛋白或酶類(lèi)亞類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 大熊貓、亞洲黑熊膜蛋白質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Mass spectrometry results of RBC membrane proteins from giant panda and Asian black bear

2.4 大熊貓、亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白功能分類(lèi)分析

在用生物功能對(duì)大熊貓及亞洲黑熊膜蛋白進(jìn)行區(qū)分后，對(duì)比可知，大熊貓與亞洲黑熊膜蛋白上都發(fā)揮了比較相似的作用，如結(jié)合、酶催化、生物識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者蛋白分類(lèi)相似，大熊貓比亞洲黑熊紅細(xì)胞膜上存在約20種與代謝相關(guān)蛋白類(lèi)。

3 討論

質(zhì)譜技術(shù)在人類(lèi)紅細(xì)胞膜蛋白的研究中已有很廣泛的應(yīng)用。2006年，Pasini等[10]對(duì)紅細(xì)胞膜蛋白通過(guò)LTQ-FT質(zhì)譜技術(shù)鑒定出252種可溶性膜蛋白，并對(duì)這些蛋白在細(xì)胞膜上存在的位置、生物學(xué)功能進(jìn)行了分類(lèi)討論。在隨后的研究中，研究人員通過(guò)對(duì)儲(chǔ)存3 d、21 d、42 d后的紅細(xì)胞膜蛋白通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞膜表面發(fā)揮酶功能的蛋白及信號(hào)轉(zhuǎn)到相關(guān)的蛋白含量下降，認(rèn)為這可能是儲(chǔ)存后的紅細(xì)胞生存能力減弱的原因[11]。一些研究人員通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)從蛋白質(zhì)組學(xué)上分析了人與小鼠的差別[12]，在紅細(xì)胞膜蛋白功能方面的研究中通過(guò)敲除小鼠對(duì)半胱氨酸的氧化過(guò)程進(jìn)行了分析[13]，還通過(guò)紅細(xì)胞胞漿蛋白的質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了先天再生障礙性貧血患者獨(dú)特的炎性反應(yīng)[14]。

由于大熊貓紅細(xì)胞膜蛋白承載著紅細(xì)胞所行使的生理功能，而目前尚無(wú)針對(duì)細(xì)胞膜蛋白的研究。在對(duì)大熊貓紅細(xì)胞膜蛋白的研究中，通過(guò)SDS-PAGE條帶分析可以發(fā)現(xiàn)，大熊貓與亞洲黑熊蛋白條帶數(shù)目相近，說(shuō)明所含蛋白種類(lèi)相似度較高(圖2)，這也提示大熊貓紅細(xì)胞膜表面蛋白和亞洲黑熊紅細(xì)胞膜表面蛋白種類(lèi)可能相差不大。在進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜研究中，我們發(fā)現(xiàn)大熊貓與亞洲黑熊的紅細(xì)胞具有功能類(lèi)似的膜蛋白組成，在這些生物功能中的代謝部分大熊貓較亞洲黑熊多20種(表2，圖3)，這提示可能大熊貓隨著生活習(xí)性特化，導(dǎo)致其體內(nèi)生命活動(dòng)過(guò)程發(fā)生了改變，最終導(dǎo)致其紅細(xì)胞膜蛋白功能的改變以適應(yīng)上述變化。本研究中未發(fā)現(xiàn)亞洲黑熊較大熊貓具有特有的膜蛋白，其可能的原因是，目前亞洲黑熊尚無(wú)參比序列及相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，故質(zhì)譜結(jié)果僅可根據(jù)大熊貓數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，可能導(dǎo)致少部分蛋白注釋存在偏差。

表2 大熊貓、亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白差異蛋白涉及生物學(xué)過(guò)程Tab.2 Distinct membrane proteins involved in different pathway in giant panda

續(xù)表2

在質(zhì)譜檢測(cè)中我們還發(fā)現(xiàn)蛋白注釋結(jié)果中有很多屬于內(nèi)膜系統(tǒng)的蛋白質(zhì)。由于成熟的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞只有細(xì)胞膜而不含有其他的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)膜系統(tǒng)。所以理論上講，由紅細(xì)胞制備的細(xì)胞膜蛋白不會(huì)有內(nèi)膜系統(tǒng)的干擾，故在大熊貓紅細(xì)胞膜上所鑒定到的其他內(nèi)膜系統(tǒng)上的蛋白來(lái)源只有一種可能，就是當(dāng)紅細(xì)胞脫核后，這些蛋白重新定位到紅細(xì)胞膜上，繼而可能發(fā)揮新的生理功能。這一過(guò)程發(fā)生的機(jī)理、膜蛋白定位的變化及與其定位到紅細(xì)胞膜后的特定生理功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)膜蛋白電泳及質(zhì)譜檢測(cè)對(duì)大熊貓及亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)大熊貓與亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白組成符合哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞膜組成規(guī)律。通過(guò)膜蛋白質(zhì)譜檢測(cè)共檢測(cè)標(biāo)定大熊貓紅細(xì)胞膜蛋白388種，亞洲黑熊紅細(xì)胞膜蛋白315種。