王伊琴 陳少博 楊 帆 包勇敢 荊文魁 常 鴻 康曉平

(1.二連海關(guān)技術(shù)中心，二連浩特，011100；2.呼和浩特海關(guān)，呼和浩特，010010；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京，010071)

野生動(dòng)物是大自然的產(chǎn)物，世界各國對(duì)珍貴、瀕危的野生動(dòng)物實(shí)行重點(diǎn)保護(hù)。黃羊(Procapragutturosa)是我國Ⅱ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，中國瀕危動(dòng)物紅皮書瀕危物種，主要分布于蒙古國的東部草原，中國的呼倫貝爾盟、錫林郭勒盟、烏蘭察布盟，并集中分布在兩國的邊境地帶。棲息于半干旱的草原，草食性，性喜群棲，集群的時(shí)間比較長，移動(dòng)的距離和范圍也大，一般在春季和秋季進(jìn)行大規(guī)模遷移，同時(shí)黃羊也受國際公約保護(hù)遷徙野生動(dòng)物保護(hù)公約的保護(hù)[1]。20世紀(jì)70年代，內(nèi)蒙古草原有野生黃羊300多萬頭，八九十年代，內(nèi)蒙古還有野生黃羊100萬頭左右。最近20年來，由于盜獵分子的瘋狂獵殺，目前估計(jì)整個(gè)內(nèi)蒙古只有幾千只[2-3]。每年冬季蒙古國大量黃羊越境到中國過冬，過冬之后又返回蒙古國，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅2015年12月9日，有近600只黃羊通過二連浩特進(jìn)入中國境內(nèi)，為保護(hù)好這批野生黃羊，有關(guān)部門日夜堅(jiān)守，密切關(guān)注野生黃羊群動(dòng)向，確保野生黃羊在中國境內(nèi)的安全。但是，在蒙古國和中國部分地區(qū)存在以獵捕野生黃羊?yàn)闃?、以獵捕野生黃羊販賣謀取利益，使野生黃羊資源遭到嚴(yán)重的破壞[4-5]。又因?yàn)槊晒艊强谔阋?、小反芻獸疫的疫區(qū)，由于黃羊肉可食用，黃羊角可入藥，通過黃羊攜帶疫病、疫情傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)日益增加，時(shí)刻威脅我國公共衛(wèi)生安全。這就要求我們加強(qiáng)保護(hù)野生動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)體系的建設(shè)，在進(jìn)出口動(dòng)物及其制品中準(zhǔn)確甄別動(dòng)物源性，確保世界遷徙野生動(dòng)物受到保護(hù)，維護(hù)公共生物安全體系，從源頭上打擊走私販賣行為，黃羊源性成分的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)研究，為保護(hù)我國瀕危野生動(dòng)物資源，為海關(guān)緝私執(zhí)法提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

目前，黃羊源性成分的檢測(cè)技術(shù)的研究尚未見有相關(guān)的報(bào)道，本研究通過對(duì)黃羊的組織分別進(jìn)行PCR和Real-time PCR檢測(cè)，分別進(jìn)行了特異性、靈敏性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明2種技術(shù)均能滿足日常的動(dòng)物源性成分的檢測(cè)要求，為保證準(zhǔn)確甄別源性成分提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

基因組DNA提取試劑盒購于Bio Dev-Tech公司，DNA凝膠回收試劑盒及pGEM-T Easy載體購于Promega公司；Taqplus DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I 及DNA Marker 為TaKaRa 公司產(chǎn)品；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購于Trans Gene Biotech公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 樣品

本試驗(yàn)是在無菌條件下采取了6份健康黃羊的皮毛、肉等組織樣品。

1.2 方法

1.2.1 引物

根據(jù)GenBank中已發(fā)表序列(DQ266332.1)，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，針對(duì)黃羊線粒體基因設(shè)計(jì)引物序列如下：

由上海生工合成。

上游引物：5′-CTAGGCAACATGCATATC-3′；

下游引物：5′-CGAGAAGAGAAATCCTTG-3′。

探針：5′-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TA MRA-3′。

1.2.2 陽性質(zhì)粒的制備和酶切鑒定

利用本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物，黃羊DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，純化后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T easy vector進(jìn)行連接，4℃水浴過夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素，X-gal和IPTG的LB瓊脂平板，于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)20 h，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行篩選。挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒提取試劑盒制備質(zhì)粒，然后對(duì)其進(jìn)行酶切和PCR鑒定，同時(shí)并送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 普通PCR的擴(kuò)增

該引物擴(kuò)增了94 bp核苷酸?；蚪M總DNA的提取按試劑盒方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，其中含有：基因組DNA 200 ng，引物0.5 μM，dNTP 200 μM，Taqplus DNA Polymerase(5 U/μL)0.5 μL，0.1M10×Ammonium Buffer，ddH2O 17 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件如下。

94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，61℃退火40 s，72℃延伸40 s，共循環(huán)36次，最后于72℃延伸8 min。

1.2.4 Real-time PCR反應(yīng)

PCR擴(kuò)增體系25 μL：Premix ExTaqTM12.5 μL，上下游引物、探針(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 7.5 μL。

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，58℃退火，延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，58℃收集熒光。

1.3 PCR和Real-time PCR的特異性試驗(yàn)

以同種方法提取等量的黃羊、牛(Bos)、羊(Caprinae)、馬(Equuscaballus)、豬(Sus)、鼠(Rattus)、雞(chicken)DNA和水(空白對(duì)照)為模版，分別進(jìn)行PCR和Real-time PCR檢測(cè)，檢測(cè)其特異性。

1.4 PCR和Real-time PCR的靈敏性試驗(yàn)

黃羊陽性質(zhì)粒濃度(97.3 μg/mL)為模板，對(duì)該陽性質(zhì)粒進(jìn)行 10 倍系列稀釋，取6個(gè)梯度的DNA濃度，分別進(jìn)行PCR及Real-time PCR擴(kuò)增，檢測(cè)反應(yīng)的靈敏性，并以其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)其靈敏性。

1.5 Real-time PCR穩(wěn)定性試驗(yàn)

黃羊陽性質(zhì)粒濃度(97.3 μg/mL)為模板，做10倍系列稀釋，取10-1—10-5倍比稀釋的5個(gè)梯度的DNA模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，共進(jìn)行3次試驗(yàn)，計(jì)算組內(nèi)和組間Ct值的變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樣品的DNA濃度及純度

所提取樣品的DNA 濃度在20.8—244 ng/μL范圍內(nèi)，A260/280在1.8—2.0間，完全可滿足PCR和Real-time PCR 檢測(cè)的要求。

2.2 普通PCR擴(kuò)增、克隆和酶切鑒定

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小與擴(kuò)增片段基本一致約為94 bp(圖1)，初步證實(shí)為黃羊的目的基因。PCR 產(chǎn)物純化后克隆到載體中，轉(zhuǎn)化后挑取陽性菌落，經(jīng)EcoR I 酶切可獲得3 000 bp和94 bp左右2個(gè)條帶，(pGEM-T Easy 載體兩端分別存在1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，這與載體和插入目的的片段大小正好相符(圖略)。同時(shí)應(yīng)用上、下游引物在重組質(zhì)粒中PCR 擴(kuò)增出大小約為94 bp 的條帶，結(jié)果表明擴(kuò)增片段已經(jīng)插入載體中(圖1)。

2.3 普通PCR的特異性試驗(yàn)

分別對(duì)黃羊、馬、牛、羊、豬、鼠、雞的DNA以及水(空白對(duì)照)進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)方法的特異性。

2.4 普通PCR的靈敏性試驗(yàn)

黃羊質(zhì)粒DNA的濃度為97.3 ng/μL 。用ddH2O依次10倍稀釋7個(gè)梯度，即每個(gè)反應(yīng)模板濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，以確定方法對(duì)單一模板的靈敏度，該方法的靈敏度為0.1 ng/μL。

2.5 Real-time PCR的特異性試驗(yàn)

用黃羊引物探針體系分別對(duì)黃羊、馬、牛、羊、豬、鼠、雞、水的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，由圖4可見，黃羊的DNA在Ct值為12.39時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他動(dòng)物組織和空白對(duì)照則沒有擴(kuò)增曲線。

2.6 Real-time PCR的靈敏性試驗(yàn)

圖5中曲線從左向右加入模板DNA濃度依次是100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 ng/μL，對(duì)應(yīng)的Ct值分別為13.24、17.77、20.07、24.56、28.06、31.65、36.12。Ct值<35的最大稀釋度溶液中的模板DNA含量為0.001 ng/μL，即為黃羊源性成分檢測(cè)的靈敏度。

以x軸代表質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，y軸代表Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖6。

根據(jù)圖6標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，當(dāng)質(zhì)粒濃度從100 ng/μL—10-4ng/μL 時(shí)，隨質(zhì)粒稀釋度的增加，對(duì)應(yīng)的Ct值也逐漸增大，且具有一定的線性關(guān)系。y=-3.7282 log 拷貝數(shù)+39.409，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6，說明在模板濃度范圍內(nèi)都具有很好的線性關(guān)系，可以用于樣品的定量分析。

2.7 Real-time PCR的組內(nèi)、組間穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1 組內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)

如表1所示，模板DNA濃度10—0.001 ng/μL的5個(gè)倍比稀釋度內(nèi)，每一稀釋度內(nèi)做3個(gè)重復(fù)，Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差從0.06—0.60，變異系數(shù)0.314%—1.797%，圖7的擴(kuò)增結(jié)果曲線也表明所建立的方法具有較好的組內(nèi)穩(wěn)定性。

表1 不同DNA濃度下組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The results of intra and inter group repeatability tests at different DNA concentrations

2.7.2 組間穩(wěn)定性試驗(yàn)

如表1所示，模板DNA濃度10—0.001 ng/μL的5個(gè)倍比稀釋度內(nèi)，每個(gè)稀釋度做一次試驗(yàn)，共做3次試驗(yàn)，Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差從0.15—3.32，變異系數(shù)0.671%—7.144%，圖8的擴(kuò)增結(jié)果曲線也表明所建立的方法具有一定的組間穩(wěn)定性。

3 討論

2013年歐洲爆發(fā)的馬肉風(fēng)波，美國“沃爾瑪狐貍?cè)庠旒佟笔录?，揭露了肉制品的摻假現(xiàn)象的嚴(yán)重性，引發(fā)了全球公眾對(duì)肉制品安全的擔(dān)憂[6]。我國食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)已將肉制品的動(dòng)物源性成分鑒定(牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測(cè))納入到常規(guī)監(jiān)測(cè)中[7]。瀕危野生動(dòng)物物種DNA鑒定技術(shù)是打擊肉制品摻假、走私，維護(hù)市場(chǎng)秩序，保護(hù)野生動(dòng)物資源，提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

3.1 基于DNA 特異性序列分析方法建立的核心內(nèi)容是選擇物種特異性DNA 靶序列。由于動(dòng)物細(xì)胞存在2套基因組DNA，分別是線粒體基因組DNA 和核基因組DNA，因此，特異性DNA 靶序列選擇時(shí)存在2種可能，一種源于線粒體基因組DNA，另外一種源于核基因組DNA。目前，報(bào)道和應(yīng)用的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法大部分是針對(duì)線粒體基因組DNA 靶序列的，如12S RNA，16S RNA，18S RNA，Cybt序列等。此外越來越多的研究開始篩選核基因組DNA 特異性靶序列，如MC1R、LF、TRF、IL-2、β-actin、cGMP、BGH、cGMP、PDEs、RyR、MY等，并將其用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)[8]。

3.2 黃羊?qū)儆诙唇强?Bovidae)，其物種進(jìn)化的同源性表明與牛的同源性大于98%，高于羊的同源性95%[9]，本研究PCR和Real-time PCR方法，對(duì)檢測(cè)的特異性分析結(jié)果，與牛、羊等未見有交叉擴(kuò)增，均有很好的特異性。

3.3 本研究中的靈敏性特點(diǎn)分析，普通PCR法靈敏度分析，模板DNA靈敏度為0.1 ng/μL，較之孫艷華等[10]建立的普通 PCR 檢測(cè)熟肉肉類來源的方法檢測(cè)限為5%，本研究更具靈敏性，同時(shí)，普通 PCR 存在耗時(shí)長、產(chǎn)物易污染等不足[11]。

Real-time PCR方法靈敏度分析，模板DNA靈敏度0.001 ng/μL，較之Jonker 等[12]建立的檢測(cè)體系 50 pg/μL 更為靈敏，靈敏度線性相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6，可以定量研究Ct值與拷貝數(shù)的關(guān)系。較之Wang等[13]建立的應(yīng)用牦牛肉的方法體系0.001%相一致，與Fang等和Druml等[14-15]建立的方法體系，檢出限1 pg相同?？傊?，本研究所設(shè)計(jì)的黃羊引物、探針體系以線粒體細(xì)胞色素b基因?yàn)槟康幕颍琑eal-time PCR方法特異性、靈敏性、穩(wěn)定性均優(yōu)于普通PCR方法，而且可以量化分析，是探索動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)方法，其缺點(diǎn)是儀器設(shè)備要求高、價(jià)格高，對(duì)于基層檢測(cè)單位不利于滿足設(shè)備要求[16]。

3.4 組內(nèi)、組間穩(wěn)定性試驗(yàn)研究分析，組內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)研究中，模板DNA 0.001 ng/μL時(shí)，平均Ct值33.23，變異系數(shù)CV%為0.018，較模板濃度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.004 3高了近1個(gè)數(shù)量級(jí)。組間穩(wěn)定性試驗(yàn)研究中，模板DNA 0.001 ng/μL時(shí)，Ct值32.49，變異系數(shù)CV%為0.071，較模板濃度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.018高5倍。因此，根據(jù)穩(wěn)定性的研究，組內(nèi)CV%、組間CV%均小于25%，符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)一的檢測(cè)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。并組內(nèi)試驗(yàn)的穩(wěn)定性好于組間試驗(yàn)。模板DNA稀釋度越高，Ct接近閾值35時(shí)，組內(nèi)、組間穩(wěn)定性試驗(yàn)Ct值的SD越高，CV%大，試驗(yàn)的穩(wěn)定性也越差。

3.5 研究成果標(biāo)準(zhǔn)化后，應(yīng)用推廣將對(duì)保障我國國境口岸野生動(dòng)物物種鑒定發(fā)揮重要的作用，為保護(hù)瀕危野生動(dòng)物資源，為海關(guān)緝私執(zhí)法提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。