麻婷婷 許四宏 周海衛(wèi)

人細(xì)小病毒B19（human parvovirus B19，B19V）屬于細(xì)小病毒亞科，紅病毒屬［1］。成年后多達(dá)40%～60%的人被B19V 感染，老年約90%的人呈抗體陽性［2］。B19V 傳播全年發(fā)生，但可能在冬季后期至夏季初見頂［3］。B19V 的唯一傳染源為患者，主要通過呼吸道傳播（飛沫、氣溶膠）、血液制品污染和垂直傳播［4］。B19V 在世界范圍內(nèi)有1 型、2 型和3 型，其中1 型可分為1a 和1b 型，3 型可以分為3a 和3b 型。1a型是目前在我國(guó)流行的主要型別，同時(shí)有少量1b 型和3 型存在［5］。目前國(guó)內(nèi)B19V 核酸檢測(cè)已有多家公司的產(chǎn)品研發(fā)成功，由于該類產(chǎn)品均無系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)和統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使得這些產(chǎn)品均未在我國(guó)獲批上市。因此，建立人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品，用于企業(yè)試劑研發(fā)的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)已刻不容緩。為規(guī)范和提高國(guó)內(nèi)此類產(chǎn)品的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)研制了人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品，并制定了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 參考品原料來源

血漿樣本由蘭州生物制品研究所、武漢生物制品研究所、深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院提供。

1.1.2 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品

世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）國(guó)際參考品（3rd WHO International Standard for Parvovirus B19 for Nucleic Acid Amplification Techniques，NIBSC code：12/208），標(biāo)示濃度為1 410 000 IU/mL。WHO 國(guó)際參考品（Parvovirus B19 DNA Nucleic Acid Amplification Technology（NAT）based assays Genotype Panel，NIBSC code：09/110），該參考品包含B19 病毒1 型、2 型和3a 型，標(biāo)示濃度分別為5.98 log10 IU/mL、5.94 log10 IU/mL和5.97 log10 IU/mL。

1.1.3 檢測(cè)試劑

初篩使用上海科華生物工程股份有限公司的人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），確認(rèn)使用In-house 巢式PCR 擴(kuò)增及測(cè)序方法，引物序列見表1［6］。巢式PCR 第一輪反應(yīng)條件為：第一步94℃熱啟動(dòng)2 min；第二步94℃20 s，55℃30 s，72℃45 s，40 個(gè) 循 環(huán)；第 三 步72℃7 min。第二輪反應(yīng)條件將循環(huán)過程中退火溫度升至58℃。

表1 人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品PCR 擴(kuò)增及測(cè)序引物［6］Table 1 PCR amplification and sequencing primers of reference panel for Human Parvovirus B19 nucleic acid detection kits［6］

協(xié)作標(biāo)定使用試劑包括蘇州華益美生物科技有限公司、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司、上海之江生物科技股份有限公司和羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司共4 家企業(yè)的產(chǎn)品。穩(wěn)定性研究使用試劑為上?？迫A生物工程股份有限公司的人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）。均勻性研究使用羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司的cobas TaqScreen DPX Test（甲肝和人細(xì)小病毒B19檢測(cè)試劑盒）檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 參考品制備

篩選及確認(rèn)后的原料樣本經(jīng)離心、過濾、稀釋及分包裝后組成參考品，分別編號(hào)為8 份陽性參考品PC01～PC08，10 份陰性參考品NC01～NC10，1 份高濃度樣本經(jīng)陰性稀釋液稀釋后得到精密度參考品（CV1、CV2）、以及1 份高濃度樣本經(jīng)稀釋得到最低檢出限參考品（L1、L2）。

1.2.2 溯源標(biāo)定

將WHO 第三代人細(xì)小病毒B19 核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC 編號(hào)12/208）進(jìn)行梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用6 家企業(yè)的產(chǎn)品對(duì)精密度和最低檢出限參考品進(jìn)行溯源標(biāo)定和賦值。

1.2.3 穩(wěn)定性及均勻性考核

本參考品為定性使用。選擇參考品中精密度以及濃度較低的陽性參考品PC04～PC08，分別經(jīng)室溫（25℃）放置24 h 及反復(fù)凍融3 次等處理后使用定性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以考核其短期穩(wěn)定性。

選擇精密度參考品CV1 和CV2 進(jìn)行均勻性研究。分別隨機(jī)抽取10 支CV1 和CV2 樣本，使用定性試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每支樣本重復(fù)檢測(cè)2 次。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)，多組間采用F檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參考品的組成

收集的樣本經(jīng)PCR 擴(kuò)增初篩、確認(rèn)和定值后確定了參考品的組成。見表2。

表2 人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品組成Table 2 Composition of reference panel for Human Parvovirus B19 nucleic acid detection kits

2.2 基因分型結(jié)果

對(duì)參考品中的陽性參考品進(jìn)行基因分型，除PC01 屬于1b 型以外，其余陽性均屬于1a 型，見圖1。

2.3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

圖1 人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品原料樣本基因進(jìn)化分析結(jié)果Figure 1 Phylogenetic tree of reference panel for Human Parvovirus B19 nucleic acid detection kits

精密度參考品CV1 和CV2 的標(biāo)定結(jié)果分別為中強(qiáng)陽性和弱陽性樣本（Ct 值及定量值數(shù)據(jù)未展示）。4 種檢測(cè)試劑對(duì)參考品進(jìn)行標(biāo)定。見表3。

表3 人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品協(xié)作標(biāo)定Table 3 Cooperative calibration of reference panel for Human Parvovirus B19 nucleic acid detection kits

參考美國(guó)食品和藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）血液篩查標(biāo)準(zhǔn)（104IU/mL）及協(xié)作標(biāo)定結(jié)果制定本參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［7］：陽性參考品符合率8/8；陰性參考品符合率10/10；精密性變異系數(shù)≤5.0%；最低檢出限參考品L1 應(yīng)為陽性，L2可為陽性或陰性。

2.4 穩(wěn)定性和均勻性

使用配對(duì)T 檢驗(yàn)對(duì)不同處理后檢測(cè)的Ct 值與-70℃保存條件下進(jìn)行比較，室溫25℃放置1 天處理的P值為0.175，反復(fù)凍融3 次處理的P值為0.174，表明2 種不同處理均不影響本參考品的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察結(jié)果見表4。

表4 人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品短期穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 Short-term stability test on reference panel for Human Parvovirus B19 nucleic acid detection kits

使用單因素方差分析對(duì)精密度參考品CV1 和CV2 的均勻性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)后顯示，CV1 和CV2 的P值 分別 為0.574（F值=0.330）和0.867（F值=0.029），表明均勻性符合要求。

3 討論

國(guó)際已有上市的B19V 核酸檢測(cè)商用試劑盒（Qiagen 公司artus Parvo B19 LC PCR Kit 和Roche公司cobas TaqScreen DPX Test）［8］。FDA 對(duì)B19V核酸檢測(cè)試劑要求必須涵蓋目前已知的所有基因型，同時(shí)需要對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證包含特異性、精密度、最低檢出限等性能指標(biāo)，歐洲藥品管理局（european medicines agency，EMA）也有類似的標(biāo)準(zhǔn)［9］。WHO 已建立了第三代人細(xì)小病毒B19 核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和第一代人細(xì)小病毒B19 核酸分型國(guó)際參考品（NIBSC 編號(hào)分別為12/208 和09/110）［10］。目前我國(guó)還沒有B19V 核酸診斷試劑的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、審評(píng)指導(dǎo)原則和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，還沒有上市的B19V 核酸檢測(cè)試劑。為對(duì)國(guó)內(nèi)此類產(chǎn)品進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)并建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究研制了人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑定性用國(guó)家參考品（編號(hào)為370005-201601）。

本課題組對(duì)最低檢出限和精密度參考品使用多家試劑進(jìn)行定值，并已將其溯源至WHO 的第三代人細(xì)小病毒B19 核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC編碼12/208）。B19V 能明確引起輸血者感染的最低病毒載量還沒有明確，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒滴度為105IU/mL 時(shí)一般不會(huì)發(fā)生感染［11-12］。因此美國(guó)FDA、歐洲藥典和國(guó)際血漿蛋白治療協(xié)會(huì)先后將混合血漿B19V DNA 含量不超過104IU/mL 作為核酸檢測(cè)篩查的標(biāo)準(zhǔn)［7，13-14］。本研究將最低檢出限參考品L1 和L2 濃度分別設(shè)定為2.4×103和2.4×102IU/mL，并要求L1 應(yīng)為陽性，L2 可為陽性或陰性，該標(biāo)準(zhǔn)既滿足上述各機(jī)構(gòu)B19 核酸檢測(cè)篩查標(biāo)準(zhǔn)又能對(duì)試劑進(jìn)行靈敏度評(píng)估并體現(xiàn)試劑間性能差異。同時(shí)為保證樣本在運(yùn)輸、保存和使用過程中的穩(wěn)定性，對(duì)參考品的穩(wěn)定性進(jìn)行了考查，結(jié)果本研究中的凍融及室溫處理方式不會(huì)影響本參考品的穩(wěn)定性。其均勻性評(píng)估結(jié)果顯示參考品的均勻性也能夠滿足使用需要。

另外，為滿足國(guó)內(nèi)企業(yè)研發(fā)試劑溯源需求，本課題組還研制了人細(xì)小病毒B19 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（編號(hào)為370023-201601），并同樣將其量值溯源至WHO 的第三代人細(xì)小病毒B19 核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，企業(yè)可用于研發(fā)試劑及質(zhì)量控制時(shí)的量值溯源、性能評(píng)估及質(zhì)量控制等。本參考品及上述標(biāo)準(zhǔn)品的研制確定了我國(guó)B19V 核酸檢測(cè)試劑的最低質(zhì)量要求，能夠?yàn)槠髽I(yè)研發(fā)相關(guān)試劑建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。