郭喜喜 王振華 胡紅軍 張立國

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，調(diào)查研究顯示，肺癌發(fā)病率與死亡率逐年上升，其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要病理類型，由于肺癌早期診斷準(zhǔn)確率較低導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)已處于中晚期［1-2］。因而尋找早期診斷肺癌的分子標(biāo)志物具有重要意義。miRNA 在肺癌組織及細(xì)胞系中異常表達(dá)，并可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程［3-4］。miR-766-3p在肝癌、腎癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-766-3p 的表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展［5-6］。TargetScan 預(yù)測顯示KIFC1 可能是miR-766-3p 的靶基因，研究表明KIFC1 在肺癌組織中上調(diào)表達(dá)，并可參與肺癌發(fā)生過程［7］。但miR-766-3p 是否可通過調(diào)控KIFC1 的表達(dá)從而參與肺癌發(fā)生發(fā)展過程尚未可知。本研究主要通過上調(diào)miR-766-3p 的表達(dá)分析其對肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對KIFC1 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2017年10月至2018年10月本院收治的25 例肺癌患者為研究對象，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為肺癌，其中男15 例，女10 例，年齡為56～70 歲，平均年齡為（63.38±6.15）歲，所有患者均接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療或化療，于術(shù)中切除肺癌組織及癌旁組織（＞5 cm）標(biāo)本，置于液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

1.2 材料與試劑

肺癌細(xì)胞A549 購自美國ATCC 細(xì)胞庫。miR-766-3p mimics、miR-NC、anti-miR-766-3p、anti-miRNC、si-KIFC1、si-NC 購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；MTT 購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；Mgtrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、P21、E-cadherin 抗體購自美國CST 公司；兔抗人KIFC1 抗體購自上海允麥生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組

A549 細(xì)胞接種于24 孔板，分別將miR-NC、miR-766-3p mimics、si-NC、si-KIFC1、anti-miR-NC、anti-miR-766-3p、miR-766-3p mimics 與pcDNA3.1、miR-766-3p mimics 與pcDNA3.1-KIFC1 轉(zhuǎn) 染 至A549 細(xì)胞，分別記作miR-NC 組、miR-766-3p 組、si-NC 組、si-KIFC1 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-766-3p 組、miR-766-3p+pcDNA3.1 組、miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 組。

1.3.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-766-3p的表達(dá)水平

采用Trizol 法提取肺癌組織、癌旁組織及A549 細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板，參照SYBR Green 試劑盒配置qRT-PCR 反應(yīng)體系，計(jì)算miR-766-3p 相對表達(dá)量。

1.3.3 肺癌組織中KIFC1 蛋白陽性表達(dá)

制備肺癌組織石蠟切片，在不同濃度乙醇中脫水后放置在檸檬酸鹽溶液中20 min，PBS 清洗后，滴加3%過氧化氫溶液室溫下反應(yīng)25 min，PBS清洗后，滴加山羊血清反應(yīng)15 min，加入稀釋后的KIFC1 一抗，放置4℃冰箱中過夜，PBS 清洗，加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫下反應(yīng)2 h，加入DAB 顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，在不同濃度的乙醇中進(jìn)行脫水處理，滴加二甲苯，中性樹脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.4 MTT 檢測細(xì)胞增殖

收集各組對數(shù)生長期A549 細(xì)胞（3×104個(gè)/mL）接種于96 孔板（100 μL/孔），分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h 時(shí)每孔中加入20 μL MTT 溶液，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，勻速振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值（OD 490 nm）。

1.3.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期A549 細(xì)胞（5×104個(gè)/mL）加入上室（200 μL/孔），下室加入DMEM 培養(yǎng)液（600 μL/孔），培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel 基質(zhì)膠后加入上室（40 μL/孔），孵育5 h，后續(xù)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

TargetScan 預(yù)測顯示KIFC1 的3′UTR 區(qū)存在miR-766-3p 的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體WT-KIFC1，構(gòu)建含有突變位點(diǎn)的突變型載體MUT-KIFC1，取對數(shù)生長期A549 細(xì)胞，WT-KIFC1、MUT-KIFC1 分別與miR-766-3p mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，參照Lipofectamine2000 試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3.7 Western blot 檢測Cyclin D1、MMP-2、P21、E-cadherin 蛋白表達(dá)

取各組A549 細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白（30 μg 蛋白上樣量），轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，孵育一抗稀釋液（1∶1 000），4℃孵育過夜，孵育二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，顯影，定影，應(yīng)用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-766-3p、KIFC1 在癌旁組織和肺癌組織中的表達(dá)

與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-766-3p 的表達(dá)水平［（1.05±0.10）vs（0.24±0.02）］顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），KIFC1 蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 肺癌和癌旁組織的病理圖（HE，×200）Figure 1 Pathological features of lung cancer and normal tissues（HE，×200）

2.2 過表達(dá)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的影響

與miR-NC 組比較，miR-766-3p 組A549 細(xì)胞活力及Cyclin D1、MMP-2 蛋白表達(dá)量顯著降低，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表1、表2。

表1 過表達(dá)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖的影響（±s）Table 1 Effects of overexpression of miR-766-3p on proliferation of A549 cells（±s）

表1 過表達(dá)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖的影響（±s）Table 1 Effects of overexpression of miR-766-3p on proliferation of A549 cells（±s）

注：與miR-NC 組比較，aP＜0.05。

分組miR-NC miR-766-3p t 值P 值n 9 9 miR-766-3p 0.22±0.02 0.81±0.08a 21.464 0.000 Cyclin D1 0.74±0.07 0.24±0.02a 20.604 0.000 P21 0.15±0.01 0.63±0.06a 23.674 0.000細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.46±0.04 0.27±0.03a 11.400 0.000 48 h 0.78±0.08 0.38±0.04a 13.416 0.000 72 h 1.03±0.10 0.47±0.05a 15.026 0.000

圖2 過表達(dá)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of miR-766-3p overexpression on proliferation，migration and invasion protein expression of A549 cells

表2 過表達(dá)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 遷移、侵襲的影響（±s）Table 2 Effects of overexpression of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

表2 過表達(dá)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 遷移、侵襲的影響（±s）Table 2 Effects of overexpression of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

注：與mir-nc 組比較，aP＜0.05。

分組miR-NC miR-766-3p t 值P 值n9 9 E-cadherin 0.23±0.02 0.82±0.08a 21.464 0.000 MMP-2 0.85±0.08 0.32±0.03a 18.610 0.000遷移細(xì)胞數(shù)150±15.2 66±6.83a 15.122 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)139±14.1 58±6.21a 15.772 0.000

2.3 miR-766-3p 靶向、調(diào)控KIFC1

TargetScan 預(yù)測顯示KIFC1 的3′UTR 含有miR-766-3p 的互補(bǔ)序列，見圖3。miR-766-3p 過表達(dá)可降低WT-KIFC1 的熒光素酶活性（P＜0.05），而對MUT-KIFC1 熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）。miR-766-3p 過表達(dá)可降低KIFC1 蛋白水平（P＜0.05），抑制miR-766-3p 表達(dá)可提高KIFC1 蛋白水平（P＜0.05）。

圖3 miR-766-3p 和KIFC1 的互補(bǔ)序列Figure 3 miR-766-3p targets and regulated KIFC1

2.4 抑制KIFC1 對細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的影響

與si-NC 組比較，si-KIFC1 組A549 細(xì)胞活力及Cyclin D1、MMP-2 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見表3、表4。

表3 抑制KIFC1 對細(xì)胞A549 增殖的影響（±s）Table 3 Effects of KIFC1 inhibition on proliferation of A549 cells（±s）

表3 抑制KIFC1 對細(xì)胞A549 增殖的影響（±s）Table 3 Effects of KIFC1 inhibition on proliferation of A549 cells（±s）

注：與si-NC 組比較，aP＜0.05。

分組si-NC si-KIFC1 t 值P 值n 9 9 KIFC1 0.85±0.08 0.40±0.04a 15.094 0.000細(xì)胞活性（490 nm）Cyclin D1 0.72±0.07 0.31±0.03a 16.151 0.000 P21 0.13±0.01 0.50±0.05a 21.769 0.000 24 h 0.47±0.04 0.32±0.03a 9.000 0.000 48 h 0.79±0.08 0.43±0.04a 12.075 0.000 72 h 1.05±0.10 0.56±0.05a 13.148 0.000

表4 抑制KIFC1 對細(xì)胞A549 遷移、侵襲的影響（±s）Table 4 Effects of KIFC1inhibition on migration and invasion of A549 cells（±s）

表4 抑制KIFC1 對細(xì)胞A549 遷移、侵襲的影響（±s）Table 4 Effects of KIFC1inhibition on migration and invasion of A549 cells（±s）

分組siNC si-KIFC1 t 值P 值n 9 9 E-cadherin 0.22±0.02 0.68±0.07a 18.956 0.000 MMP-2 0.84±0.08 0.45±0.04a 13.081 0.000遷移細(xì)胞數(shù)152±15.2 76±7.63a 13.406 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)142±14.1 69±7.11a 13.869 0.000

2.5 過表達(dá)KIFC1 能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的抑制作用

相較于miR-766-3p+pcDNA3.1 組，miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 組細(xì)胞活力及Cyclin D1、MMP-2 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見圖4、表5、表6。

3 討論

圖4 過表達(dá)KIFC1 能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的作用Figure 4 Overexpression of KIFC1 can reverse the effect of miR-766-3p on proliferation，migration and invasion protein expression of A549 cells

本研究結(jié)果顯示肺癌組織中miR-766-3p 的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，提示miR-766-3p在肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明miR-766-3p 在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可通過靶向Wnt3a 表達(dá)而抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展［8］。研究表明miR-766-3p 低表達(dá)可能參與結(jié)腸癌發(fā)生過程［9］。相關(guān)報(bào)道指出miR-766-3p 表達(dá)量降低可能與非小細(xì)胞肺癌紫杉醇耐藥性有關(guān)［10］。本研究結(jié)果顯示，miR-766-3p 過表達(dá)可顯著降低肺癌細(xì)胞活力，減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，提示miR-766-3p 過表達(dá)可能抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-766-3p 過表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，本研究采用Western blot 法檢測增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示miR-766-3p 過表達(dá)可明顯抑制Cyclin D1 的表達(dá)，并可促進(jìn)P21 的表達(dá)。同時(shí)研究表明E-cadherin 表達(dá)水平降低可促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲［11］。下調(diào)MMP-2 的表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力［12］。本研究結(jié)果顯示，miR-766-3p 過表達(dá)可促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)，而抑制MMP-2 的表達(dá)，提示miR-766-3p 過表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-766-3p 過表達(dá)可減弱肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

表5 過表達(dá)KIFC1 能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖的抑制作用（±s）Table 5 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on A549 cell proliferation（±s）

表5 過表達(dá)KIFC1 能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 增殖的抑制作用（±s）Table 5 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on A549 cell proliferation（±s）

注：與miR-NC 組比較，aP＜0.05；與miR-766-3p+pcDNA3.1 組比較，bP＜0.05。

分組miR-NC miR-766-3p miR-766-3p+pcDNA3.1 miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 F 值P 值n 9 9 9 9 KIFC1 0.82±0.08 0.38±0.04a 0.36±0.04 0.67±0.07b 125.855 0.000 Cyclin D1 0.73±0.07 0.23±0.02a 0.24±0.02 0.58±0.06b 242.194 0.000 P21 0.14±0.01 0.61±0.06a 0.62±0.06 0.20±0.02b 311.494 0.000細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.47±0.04 0.26±0.03a 0.28±0.03 0.38±0.04b 67.860 0.000 48 h 0.78±0.08 0.36±0.04a 0.35±0.04 0.65±0.06b 125.546 0.000 72 h 1.05±0.10 0.48±0.05a 0.47±0.05 0.89±0.09b 133.961 0.000

表6 過表達(dá)KIFC1 能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 遷移、侵襲的抑制作用（±s）Table 6 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

表6 過表達(dá)KIFC1 能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 對細(xì)胞A549 遷移、侵襲的抑制作用（±s）Table 6 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

注：與miR-NC 組比較，aP＜0.05；與miR-766-3p+pcDNA3.1 組比較，bP＜0.05。

分組miR-NC miR-766-3p miR-766-3p+pcDNA3.1 miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 F 值P 值n9 9 9 9 E-cadherin 0.21±0.02 0.82±0.08a 0.84±0.08 0.28±0.03b 293.511 0.000 MMP-2 0.84±0.08 0.33±0.03a 0.31±0.03 0.70±0.07b 194.657 0.000遷移細(xì)胞數(shù)152±15.2 65±6.83a 66±6.81 121±12.3b 139.399 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)139±14.1 59±6.21a 57±6.05 114±11.6b 147.064 0.000

為進(jìn)一步探究miR-766-3p 調(diào)控肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)KIFC1 是miR-766-3p 的靶基因。研究表明KIFC1 可通過調(diào)節(jié)HMGA1 的表達(dá)從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展［13］。研究表明驅(qū)動蛋KIFC1 可通過激活A(yù)kt /GSK3β 信號傳導(dǎo)及促進(jìn)EMT 轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［14］。相關(guān)報(bào)道指出miR-135a 可通過靶向抑制KIFC1的表達(dá)從而抑制胃癌發(fā)生發(fā)展［15］。本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中KIFC1 的表達(dá)水平升高，提示KIFC1 在肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮癌基因作用。本研究進(jìn)一步分析顯示，抑制KIFC1 的表達(dá)可明顯降低肺癌細(xì)胞活力，并可減少肺癌細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，提示抑制KIFC1 的表達(dá)可減弱肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。同時(shí)，本研究將miR-766-3p 過表達(dá)與KIFC1 過表達(dá)共同處理肺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多，并可促進(jìn)Cyclin D1、MMP-2 的表達(dá)，而抑制P21、E-cadherin的表達(dá)，提示KIFC1 過表達(dá)能逆轉(zhuǎn)miR-766-3p 過表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。本研究從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-766-3p 過表達(dá)可通過抑制KIFC1 的表達(dá)從而降低肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，miR-766-3p 可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其主要通過負(fù)向調(diào)控靶基因KIFC1的表達(dá)而發(fā)揮作用，可為肺癌的基因治療提供潛在靶點(diǎn)。