秦少杰, 白 玉, 劉虎威

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,北京分子科學(xué)國家研究中心,北京 100871)

細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本單位[1],由于遺傳因素、生化噪音[2]、細(xì)胞微環(huán)境[3]等諸多因素使得單個(gè)細(xì)胞之間存在著廣泛的異質(zhì)性。因此,單細(xì)胞研究不僅使人類對(duì)細(xì)胞與生命的本質(zhì)有更為精確的認(rèn)識(shí),也為疾病的診斷、分型、治療以及預(yù)后提供了更為強(qiáng)有力的工具[4,5]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,可以為其提供更為直接且更有價(jià)值的表型信息,因此成為單細(xì)胞研究的熱點(diǎn)目標(biāo)。單細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多,豐度低,動(dòng)態(tài)分布范圍寬[6]且無法擴(kuò)增,因此對(duì)檢測(cè)手段提出了更高的靈敏度要求。在眾多高靈敏分析方法中,熒光檢測(cè)方法的靈敏度可以達(dá)到單分子水平[7],并且具有動(dòng)態(tài)跟蹤能力[8],但是其蛋白質(zhì)檢測(cè)通量有限。然而電化學(xué)檢測(cè)方法雖然細(xì)胞干擾小[9],但受限于蛋白質(zhì)通量[10]以及電化學(xué)活性[11]的要求,無法對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。質(zhì)譜作為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一種常規(guī)方法,其靈敏度高,通過已有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,可以同時(shí)對(duì)上萬種蛋白質(zhì)進(jìn)行定性以及定量,并且可以提供豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。但是由于單個(gè)體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量平均只有約100 pg[6],利用質(zhì)譜直接進(jìn)行檢測(cè)會(huì)面臨樣本復(fù)雜度和單細(xì)胞靈敏度等挑戰(zhàn),因此質(zhì)譜前的分離技術(shù)對(duì)于提高方法檢測(cè)靈敏度以及蛋白質(zhì)定性定量的準(zhǔn)確度來說十分必要。目前,基于質(zhì)譜的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的綜述仍較少[6,12-16],并且以分離方式為主線進(jìn)行梳理的還未見報(bào)道。本文綜述了近幾年基于質(zhì)譜的具有代表性的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法及其應(yīng)用。根據(jù)質(zhì)譜分析前分離技術(shù)的差異,我們從基于毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)以及無分離的直接檢測(cè)模式等3方面進(jìn)行介紹,并從細(xì)胞以及蛋白質(zhì)分析通量,方法靈敏度,蛋白質(zhì)來源及其豐度,以及方法的應(yīng)用等角度對(duì)上述方法進(jìn)行總結(jié)與比較。

1 基于毛細(xì)管電泳的分離

毛細(xì)管電泳因其成本較低,分析速度快、分離效率高,已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本的分離分析[17]。CE具有nL級(jí)進(jìn)樣量,可直接在細(xì)胞或組織中進(jìn)行微區(qū)取樣,從而避免基質(zhì)干擾[18]、氧化損傷[19]等,基于CE-MS的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究及應(yīng)用開展較早。2014年,Sun等[20]借助超靈敏的電驅(qū)動(dòng)鞘液型接口將毛細(xì)管區(qū)帶電泳與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合,從300 ng Hela細(xì)胞的蛋白酶解液中鑒定到2 100種蛋白質(zhì),并對(duì)牛血清白蛋白的酶解液中添加的血管緊張肽Ⅱ進(jìn)行檢測(cè)[21],檢出限可以低至2 amol,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值小于4%。與少量細(xì)胞或者少量蛋白酶解液的分析相比,對(duì)單個(gè)細(xì)胞中內(nèi)源蛋白質(zhì)的分析更能反映細(xì)胞的狀態(tài)和功能。受限于方法的靈敏度,因此人們首先嘗試在較大的單細(xì)胞中利用CE-MS進(jìn)行內(nèi)源蛋白質(zhì)的分析,其中最具代表性的就是Nemes教授課題組的工作。該課題組[22]首先將目光瞄準(zhǔn)經(jīng)典的16-細(xì)胞非洲爪蟾早期胚胎的囊胚細(xì)胞(見圖1a)。利用顯微解剖的方法從胚胎中分離得到單細(xì)胞,之后依次經(jīng)歷細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)還原與烷基化,以及過夜酶解等蛋白質(zhì)組學(xué)前處理流程,最后通過毛細(xì)管電泳-微升電噴霧-高分辨質(zhì)譜(CE-μESI-HRMS)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性以及定量分析,最終從單個(gè)囊胚細(xì)胞(直徑約150 μm)的20 ng非卵黃蛋白中鑒定到了1 630種蛋白質(zhì)。通過比較不同發(fā)育階段的胚胎細(xì)胞的蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在胚胎的轉(zhuǎn)錄程序尚未開始的發(fā)育階段早期,細(xì)胞沿著胚胎的多個(gè)體軸的翻譯模式具有顯著的異質(zhì)性,該結(jié)果為之前報(bào)道的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果[23]提供了補(bǔ)充。毛細(xì)管由于內(nèi)徑小于囊胚細(xì)胞的大小(見圖1b),因此在光學(xué)顯微鏡的指導(dǎo)下,可以利用毛細(xì)管對(duì)16-細(xì)胞胚胎特定區(qū)域進(jìn)行采樣,取樣速度不僅更快,也提高了空間分辨率。Lombard-Banek等[19]對(duì)胚胎進(jìn)行亞細(xì)胞區(qū)域采樣后,提取物在壓力作用下轉(zhuǎn)移至微管中進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解。進(jìn)樣10 nL酶解液后,利用毛細(xì)管電泳-納升電噴霧-高分辨質(zhì)譜分析,得到低至700 zmol的檢出限,并在5 ng蛋白酶解物中鑒定到約800種蛋白質(zhì)。利用該方法分析胚胎細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分裂分化過程中的蛋白質(zhì)組變化。結(jié)果表明,與顯微解剖方法相比,微采樣的方法耗樣少、采樣流程簡(jiǎn)化,且由于基質(zhì)干擾的大大降低使蛋白質(zhì)鑒定能力顯著增強(qiáng)。除此之外,該課題組還對(duì)體積略小一些的單個(gè)活斑馬魚胚胎進(jìn)行了研究,通過控制肽段流出速度使之與質(zhì)譜的數(shù)據(jù)采集周期相匹配,進(jìn)一步提高了肽段的分析和鑒定能力,研究結(jié)果也證實(shí)了不同類型的胚胎細(xì)胞間的表達(dá)異質(zhì)性。而在CE前加入預(yù)分離過程,可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。Choi等[24]通過在CE前加入用于預(yù)分離的反相C18微柱,對(duì)單細(xì)胞水平下的老鼠海馬體神經(jīng)元的蛋白質(zhì)酶解物進(jìn)行了分析(見圖1c),最終從500 pg蛋白酶解物中鑒定到141個(gè)蛋白質(zhì)。雖然這一靈敏度已接近單細(xì)胞水平,但樣本復(fù)雜度相比單個(gè)細(xì)胞仍較低。此外,其他高靈敏分析技術(shù)也被用于單細(xì)胞檢測(cè),Geng等[25]將毛細(xì)管電滲驅(qū)動(dòng)與激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了單個(gè)Hela細(xì)胞中Her2蛋白的原位檢測(cè)。類似的,Chen等[26]利用可以透膜的熒光探針實(shí)現(xiàn)單個(gè)單核巨噬細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸組織蛋白酶家族的標(biāo)記與檢測(cè)。盡管借助熒光的檢測(cè)技術(shù)靈敏度明顯提高,但是蛋白質(zhì)通量仍較低,遠(yuǎn)未達(dá)到組學(xué)的研究需要。因此發(fā)展基于毛細(xì)管電泳的高通量質(zhì)譜方法仍然十分必要。

圖 1 基于毛細(xì)管電泳的單細(xì)胞蛋白質(zhì)研究[19,22,24,28]Fig. 1 Single cell protein studies based on capillary electrophoresis (CE)[19,22,24,28] a. workflow of single embryo cell proteomic study through microdissection and bottom-up routine; b. workflow of label free microsampling single cell proteomics; c. combination of CE with RP fractionation to enhance peptides separation; d. successive subcellular microsampling from cytoplasm to nucleus.

如前所述,利用毛細(xì)管的微小管徑實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)容物的提取以及轉(zhuǎn)移,可避免單細(xì)胞有限體積的內(nèi)容物由于容器和管路吸附等原因造成的樣品損失,對(duì)于后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。Lee等[27]對(duì)生長在毛細(xì)管外壁的海兔神經(jīng)元施加側(cè)向刺激后,將釋放的神經(jīng)肽通過位于反射方向的填充毛細(xì)管柱(PEMC)進(jìn)行收集,洗脫后利用基質(zhì)輔助激光解吸附離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)檢測(cè)刺激過程中單個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)肽含量的變化。將毛細(xì)管的直徑進(jìn)一步縮小至普通單細(xì)胞尺寸范圍內(nèi)(≤10 μm),可以實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率的直接檢測(cè)。Zhang等[28]利用管徑10 μm的毛細(xì)管對(duì)田螺特定神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核進(jìn)行先后取樣(見圖1d),進(jìn)而利用離子淌度質(zhì)譜(IMMS)發(fā)現(xiàn)了一種新的神經(jīng)肽物種,揭示了神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域表達(dá)異質(zhì)性。

綜上,基于CE-MS的單細(xì)胞分析應(yīng)用主要集中在大體積細(xì)胞的蛋白質(zhì)組研究上,其實(shí)驗(yàn)流程與常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)基本一致。利用比單細(xì)胞尺寸更小的毛細(xì)管管徑對(duì)亞細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行內(nèi)容物的提取以及轉(zhuǎn)移,是毛細(xì)管應(yīng)用的一大特色。但CE與質(zhì)譜接口的穩(wěn)定性不足、CE方法重復(fù)性略差、電泳分離過程受pH值和溫度等因素的影響,以及蛋白酶解物在電泳過程中的吸附造成樣本損失等問題的存在,限制了CE-MS在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此亟待開發(fā)更為實(shí)用、簡(jiǎn)便、易重復(fù)的方法。

2 基于液相色譜的分離

與毛細(xì)管電泳相比,液相色譜,尤其是納升液相色譜(nanoLC)在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用更為廣泛[14],這主要依賴于其良好的重現(xiàn)性、nL級(jí)進(jìn)樣量、較低的流速(nL/min)、較少的樣品損失以及與nanoESI-MS的良好串聯(lián)能力。其中,μm級(jí)內(nèi)徑的色譜柱提供了更高的分離能力,大大提高了被分析物的信號(hào)強(qiáng)度。nanoLC與高靈敏納升電噴霧質(zhì)譜的聯(lián)用,被廣泛應(yīng)用于大體積的胚胎或生殖細(xì)胞,以及體細(xì)胞中。Sun等[29]利用納升液相色譜的反相分離模式研究了非洲爪蟾早期胚胎的囊胚細(xì)胞,單次實(shí)驗(yàn)從16細(xì)胞分裂階段的細(xì)胞中鑒定到了1 400種蛋白質(zhì)類別(見圖2a),通過比較不同階段蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,證實(shí)了隨著分化程度的不斷加深,囊胚細(xì)胞間的異質(zhì)性逐漸增強(qiáng)。為了進(jìn)一步提高肽段間的分離效果,Sun等[29]利用強(qiáng)陽離子交換色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離,然后利用超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)進(jìn)行分析,借助8通道等重標(biāo)簽相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)策略,一次實(shí)驗(yàn)比較了胚胎細(xì)胞的4個(gè)不同分化階段(每階段細(xì)胞利用兩個(gè)通道標(biāo)記),且鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目提升到4 000種[30]。在體細(xì)胞分析方面,Slavov課題組[31]2018年發(fā)展了一種基于LC分離的單細(xì)胞蛋白質(zhì)定性以及相對(duì)定量方法----單細(xì)胞蛋白組學(xué)質(zhì)譜(SCoPE-MS)。該方法首先在顯微鏡下將單個(gè)Hela細(xì)胞挑選至玻璃管中,經(jīng)過超聲破碎、過夜酶解等蛋白質(zhì)前處理步驟后,利用一系列串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag,TMT)標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同細(xì)胞間的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。標(biāo)記后的不同細(xì)胞酶解產(chǎn)物混合后利用LC-MS/MS分析(見圖2b)。工作中引入了“載體”(carriers)這一概念,即將上百個(gè)細(xì)胞按照單細(xì)胞的操作流程進(jìn)行樣品處理,利用單獨(dú)的TMT通道進(jìn)行標(biāo)記,再與待測(cè)細(xì)胞混合后同時(shí)檢測(cè)。載體的存在減少了單細(xì)胞樣品由于表面吸附造成的損失,同時(shí)為質(zhì)譜離子化過程提供足夠的多肽,以獲得足夠的信息供后續(xù)多肽的鑒定。這一概念的提出為后續(xù)單細(xì)胞技術(shù)[32]的發(fā)展提供了重要參考。利用這一技術(shù),他們研究了小鼠胚胎干細(xì)胞分化過程中蛋白質(zhì)組層面的變化,并對(duì)不同分化時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行了聚類分析,揭示了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組方面的相似性以及差異性。然而,該方法的細(xì)胞分析通量依然有限,樣品處理時(shí)間較長且蛋白質(zhì)覆蓋度不高。為了克服上述問題,該課題組[33]發(fā)展了第二代單細(xì)胞蛋白組學(xué)質(zhì)譜技術(shù),其主要改進(jìn)在于通過在純水中冷熱交替實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解;引入微孔板進(jìn)行細(xì)胞樣品處理從而提高通量;通過自動(dòng)化操作提高分析效率。此外,結(jié)合數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)下的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化(DO-MS)以及數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)下的保留時(shí)間歸屬(DART-ID)兩種算法,實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)參數(shù)的交互優(yōu)化,并提高了蛋白質(zhì)歸屬的置信度,全方位地優(yōu)化了單細(xì)胞蛋白組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)。利用該方法分析了在沒有極化細(xì)胞因子的情況下,均質(zhì)單核細(xì)胞分化成類巨噬細(xì)胞的過程,揭示了類巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)組連續(xù)變化的狀態(tài)以及類巨噬細(xì)胞可能出現(xiàn)的異質(zhì)性現(xiàn)象。得益于更少的樣本損失及較高的分析通量,人們不斷嘗試在類似微孔板的微小體積內(nèi)進(jìn)行單細(xì)胞樣品處理。張祥民課題組[34]于2015年報(bào)道了利用直接細(xì)胞進(jìn)樣、在線酶解、nanoLC-MS/MS分析的方法建立的第一代用于100個(gè)細(xì)胞分析的集成蛋白組分析裝置(iPAD-100)。通過采用更細(xì)的色譜柱(22 μm)、更小直徑的ESI噴針(3 μm)以及更高靈敏度的質(zhì)譜,他們發(fā)展了iPAD-1方法(見圖2c)[35]。結(jié)合毛細(xì)管的單細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力,在2 nL體積中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的管內(nèi)裂解、蛋白質(zhì)消化,通過后續(xù)的nanoLC-MS/MS分析,從單個(gè)Hela細(xì)胞中平均鑒定到126種蛋白質(zhì)。

圖 2 基于液相色譜的單細(xì)胞蛋白質(zhì)研究[29,31,35,39]Fig. 2 Single cell protein studies based on liquid chromatography[29,31,35,39] a. the pipeline of single cell proteomics on single embryo blastomeres; b. workflow of single cell ProtEomics by mass spectrometry (SCoPE-MS),including sonication lysis followed by digestion and tandem mass tag (TMT) labeling; c. conceptual diagram of integrated capillary-assisted integrated proteome analysis device-1 (iPAD-1); d. workflow of nanodroplet processing in one pot for trace samples single cell proteomic analysis platform.

微流控技術(shù)由于具備以微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操控的特點(diǎn),從而具有高集成性、高通量、自動(dòng)化、廉價(jià)易得的優(yōu)勢(shì)[36],近年來在單細(xì)胞分析技術(shù)中發(fā)展迅速。此外,納升級(jí)液滴中存在明顯的微滴加速現(xiàn)象[37],也會(huì)提高蛋白質(zhì)前處理的效率,因此基于液滴的微流控技術(shù)為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了新的、有效的工具。

2018年,Fang課題組[38]構(gòu)建了納升級(jí)空氣-油界面的液滴負(fù)載芯片(oil-air droplet chip)。該芯片引入了油層,避免了有限體積液滴的揮發(fā),使得細(xì)胞裂解、酶解等過程均可在一個(gè)液滴中進(jìn)行,有效避免了單細(xì)胞樣本的損失。樣本處理后通過將每一個(gè)液滴吸入毛細(xì)管中,進(jìn)入nanoLC-MS/MS進(jìn)行分析。幾乎在該技術(shù)出現(xiàn)的同時(shí),Zhu等[39]也建立了一個(gè)納升級(jí)反應(yīng)器來實(shí)現(xiàn)少量細(xì)胞的蛋白質(zhì)前處理,構(gòu)建了一種痕量樣品一體化處理平臺(tái),簡(jiǎn)稱nanoPOTS(nanodroplet processing in one pot for trace samples)(見圖2d)。其中每個(gè)液滴的體積僅有200 nL(面積為0.8 mm2),且利用石蠟?zāi)みM(jìn)行密封可大大減少樣品損失。利用該方法可從10～140個(gè)Hela細(xì)胞中鑒定到1 500～3 000種蛋白質(zhì)。隨后,他們對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化,包括引入流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行單細(xì)胞的準(zhǔn)確分選[40],利用TMT技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量[32],使用更細(xì)管徑的nanoLC柱進(jìn)行分離,以及采用超高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集[41]等。經(jīng)過對(duì)nanoPOTS技術(shù)的多步優(yōu)化和改進(jìn),最終在標(biāo)記條件下實(shí)現(xiàn)單個(gè)Hela細(xì)胞中1 400種蛋白質(zhì)的鑒定,在無須標(biāo)記條件下實(shí)現(xiàn)了大約360種蛋白質(zhì)的鑒定,這也是迄今為止無標(biāo)記條件下在單個(gè)體細(xì)胞中鑒定到的最多蛋白質(zhì)數(shù)目。

總結(jié)上述工作可以發(fā)現(xiàn),基于液相色譜的單細(xì)胞樣本處理體積逐漸降至nL級(jí)別,將一系列蛋白質(zhì)組學(xué)樣品處理步驟整合在微小體積中,通過設(shè)置密封條件、減少洗滌步驟等方式來降低樣品損失,進(jìn)而結(jié)合nanoLC-MS進(jìn)行分離和檢測(cè)。然而,細(xì)胞裂解過程的充分與否,蛋白質(zhì)前處理的步驟是否完整高效,以及是否對(duì)肽段進(jìn)行標(biāo)記等步驟仍然是影響蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)目與種類的重要因素。

3 無分離手段的直接檢測(cè)

與借助CE和LC進(jìn)行質(zhì)譜前蛋白質(zhì)分離相比,不經(jīng)酶解和分離而直接進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法由于待測(cè)物含量低、樣品復(fù)雜程度提高,導(dǎo)致檢測(cè)到的蛋白質(zhì)種類十分有限。但其樣品前處理步驟大大簡(jiǎn)化,蛋白質(zhì)間的相對(duì)位置關(guān)系得以一定程度的保留,可提供目標(biāo)分子的空間分布信息,為質(zhì)譜成像提供了可能。其中最具代表性的技術(shù)有MALDI-MS以及二次離子質(zhì)譜(SIMS)、無機(jī)質(zhì)譜流式及其成像等。

MALDI-MS因其較高的空間分辨率,可以同時(shí)對(duì)組織中上百種小分子的種類及其分布進(jìn)行分析[42],因此在質(zhì)譜成像中表現(xiàn)突出。Zavalin等[43]首先開發(fā)了真空透射式MALDI離子源,用于證實(shí)胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素的亞細(xì)胞定位,由于透射式的聚焦光路特點(diǎn),該方法可實(shí)現(xiàn)1 μm的空間分辨率。然而,由于真空條件下細(xì)胞生理狀態(tài)難以保持,該方法無法真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)狀態(tài)。而常壓基質(zhì)輔助激光解吸附離子化質(zhì)譜(AP-MALDI-MS)可在接近細(xì)胞生理狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行分析,但是方法的分析靈敏度不足,使其在單細(xì)胞層面的應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)。2017年,Kompauer等[44]在AP-MALDI離子源的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),通過激光共軸反射式的設(shè)計(jì),以及使用較大數(shù)值孔徑的聚焦物鏡,獲得了1.4 μm的激光空間分辨率,以及大于100 000的質(zhì)量分辨率,這也是目前AP-MALDI離子源所能達(dá)到的最高分辨率,并實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞分辨率下肽段以及脂質(zhì)代謝物的分析。由于傳統(tǒng)小分子基質(zhì)的干擾和離子抑制現(xiàn)象,利用MALDI離子源對(duì)細(xì)胞中小分子代謝物的鑒定相對(duì)困難。Comi等[45]結(jié)合液相微萃取手段,在MALDI-MS所提供的信息輔助下,對(duì)不同肽段含量的胰島細(xì)胞進(jìn)行分類,并采用萃取的方式對(duì)代謝物進(jìn)行后續(xù)ESI檢測(cè),該方法避免了有機(jī)基質(zhì)對(duì)代謝物檢測(cè)的干擾,實(shí)現(xiàn)了代謝物與多肽的共同檢測(cè)。為了進(jìn)一步提高M(jìn)ALDI離子化效率,Niehaus等[46]在透射式MALDI成像裝置中引入了紅外激光誘導(dǎo)的后離子化過程,使得離子產(chǎn)率與靈敏度提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí),空間分辨率達(dá)到600 nm,有望對(duì)一些低豐度肽段以及蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞區(qū)域的成像。如前所述,MALDI基質(zhì)會(huì)對(duì)待測(cè)分子檢測(cè)產(chǎn)生抑制效應(yīng),因此如果將待測(cè)分子與基質(zhì)在成像前進(jìn)行分離,則會(huì)顯著改善檢測(cè)效果。Li等[47]利用納秒激光觸發(fā)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了局域空間(大約50 μm)內(nèi)微電場(chǎng)和溫度梯度的構(gòu)建,以及蛋白質(zhì)表面賴氨酸的標(biāo)記,利用神經(jīng)肽與基質(zhì)小分子的遷移能力差異來實(shí)現(xiàn)兩者的分離,從而提高小鼠腦組織中神經(jīng)肽段檢測(cè)靈敏度。該方法有望進(jìn)一步拓展到單細(xì)胞水平。此外,Küster等[48]借助微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)MALDI靶板上的單液滴分散,利用MALDI-MS對(duì)單液滴中血管緊張肽的酶解產(chǎn)物進(jìn)行了監(jiān)控。如將該方法與單細(xì)胞分散進(jìn)樣相結(jié)合,可避免細(xì)胞間的交叉污染,有望用于單細(xì)胞的高通量分析。

SIMS自從誕生之初就以極高的空間分辨率以及三維動(dòng)態(tài)成像能力在質(zhì)譜成像領(lǐng)域獨(dú)樹一幟。納米二次離子質(zhì)譜(nanoSIMS)技術(shù)的橫向分辨率甚至達(dá)到100 nm以內(nèi)[49],從空間分辨率的角度與單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平相匹配。然而,有機(jī)分子和生物大分子的分析一直是SIMS的分析瓶頸。此外,SIMS技術(shù)對(duì)真空條件的要求高、同位素干擾明顯以及定性能力差等因素的存在,也給單細(xì)胞蛋白質(zhì)的研究帶來了巨大阻礙[50,51]。截至目前,這方面的工作仍十分有限?，F(xiàn)有方法多采用借助低背景同位素進(jìn)行蛋白標(biāo)記后檢測(cè)的方式,研究通量大為降低。Vreja等[52]構(gòu)建了一種F19同位素?zé)晒怆p功能探針,通過非天然氨基酸插入以及點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將探針固定在靶蛋白表面,實(shí)現(xiàn)了SIMS以及熒光顯微鏡下單細(xì)胞雙通道三維立體成像。

無機(jī)質(zhì)譜流式(mass cytometry)在無機(jī)質(zhì)譜免疫分析方法的基礎(chǔ)上[53],集成了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的高通量,從原理上避免了熒光通道之間的干擾,大大提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)量和通量[54]。發(fā)展至今,已經(jīng)在臨床診斷[4,55]、藥物篩選[56]等眾多生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。無機(jī)質(zhì)譜流式的原理是通過將稀土元素與抗體偶聯(lián)形成探針,進(jìn)而與細(xì)胞或者組織進(jìn)行孵育,實(shí)現(xiàn)探針的識(shí)別。將分散后的單細(xì)胞以霧滴形式引入電感耦合等離子體-質(zhì)譜(ICP-MS)進(jìn)行檢測(cè)。通過檢測(cè)探針上標(biāo)記的稀土元素的含量就可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中相應(yīng)蛋白質(zhì)的定量,從而得到不同單細(xì)胞的表達(dá)圖譜。2017年,Bodenmiller課題組[57]應(yīng)用無機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞儀分析了HEK 293T細(xì)胞中表皮生長因子受體信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及其動(dòng)態(tài)變化與20種節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)豐度的關(guān)系,揭示了信號(hào)網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的豐度依賴性,并且證實(shí)了新的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。此外,該課題組[55]還將其應(yīng)用于固定組織的二維成像。利用探針標(biāo)記組織后,通過直徑1 μm的紫外激光實(shí)現(xiàn)標(biāo)記組織表面稀土元素的解吸附,進(jìn)而在氣流帶動(dòng)下完成后續(xù)的ICP-MS檢測(cè)。該方法同時(shí)定量了腫瘤組織中與乳腺癌相關(guān)的32種蛋白標(biāo)志物的含量,在證實(shí)原有4種經(jīng)典的乳腺癌疾病分型基礎(chǔ)上,進(jìn)一步提出了更多亞型的分類。值得注意的是,當(dāng)時(shí)他們并沒有整合空間信息來進(jìn)行細(xì)胞分型,且病人樣本數(shù)目較少。近期,他們對(duì)352個(gè)乳腺癌病人的組織進(jìn)行了成像質(zhì)譜流式的分析[4],通過加入臨近細(xì)胞簇的信息,創(chuàng)造性地提出了“細(xì)胞群落”的概念,并且據(jù)此產(chǎn)生的分型結(jié)果與長達(dá)15年的病人生存曲線結(jié)果有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。此外,他們后續(xù)結(jié)合了基因組[58]以及轉(zhuǎn)錄組[59]的視角對(duì)乳腺癌疾病給出了更為綜合的多組學(xué)解釋。該工作證實(shí)了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)甚至多組學(xué)的研究對(duì)于腫瘤的精準(zhǔn)診斷至關(guān)重要,無疑將推動(dòng)單細(xì)胞技術(shù)在癌癥精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

除了檢測(cè)與抗體偶聯(lián)的稀土元素含量外,利用一些有機(jī)質(zhì)譜標(biāo)簽也可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)信號(hào)的轉(zhuǎn)移甚至放大檢測(cè)。相比無機(jī)質(zhì)譜流式,有機(jī)質(zhì)譜流式的方法不局限于稀土元素的種類以及純度,可設(shè)計(jì)性更強(qiáng),并且具有更好的信號(hào)放大能力,因此在未來有更大的發(fā)展空間。本課題組在這一領(lǐng)域開展了相關(guān)工作,例如Xu等[60]將質(zhì)譜標(biāo)簽與靶標(biāo)蛋白的抗體自組裝在Au納米顆粒表面,與細(xì)胞孵育實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)識(shí)別標(biāo)記后,利用芯片噴霧實(shí)現(xiàn)多通道小分子標(biāo)簽的解離與檢測(cè),從而表征多種靶標(biāo)蛋白的濃度。該方法的檢出限可以低至zmol,已經(jīng)比較接近單細(xì)胞的水平。進(jìn)而Xu等[61]結(jié)合微流控芯片實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞排列,并利用nanoESI-HRMS,搭建了多維度有機(jī)質(zhì)譜流式細(xì)胞分析平臺(tái)。通過檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)記質(zhì)量標(biāo)簽和細(xì)胞內(nèi)容物小分子,該平臺(tái)創(chuàng)新性地實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的6種蛋白質(zhì)及84種代謝物的同時(shí)檢測(cè),并在多種腫瘤細(xì)胞分型和腫瘤耐藥異質(zhì)性研究中開展應(yīng)用。

表 1 代表性的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

無分離方法直接檢測(cè)的模式操作省去了繁雜的樣品前處理步驟,操作相對(duì)簡(jiǎn)單,其中MALDI成像無需借助標(biāo)記手段,但是截至目前空間分辨率比較有限,并且檢測(cè)目標(biāo)局限于部分代謝物以及肽段,而在成像前進(jìn)行基質(zhì)預(yù)分離可有效提高信號(hào)強(qiáng)度。而質(zhì)譜流式以及SIMS需要借助標(biāo)記的方法來進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)移,提供了高分辨的空間位置信息,其中無機(jī)質(zhì)譜流式由于其多組學(xué)兼容能力,目前在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域有較多的應(yīng)用,而有機(jī)質(zhì)譜流式由于其標(biāo)簽設(shè)計(jì)更為靈活且具有更強(qiáng)的信號(hào)放大能力,因此在單細(xì)胞分析方面正逐漸嶄露頭角。

綜上,我們將基于不同分離方式的單細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)譜研究方法歸納于表1中,從表中可見不同的方法具有其各自的優(yōu)勢(shì)與局限。毛細(xì)管電泳的方法雖然成本較低,設(shè)備簡(jiǎn)單以及分離能力強(qiáng),但是由于樣品損失、細(xì)胞通量低,目前仍局限于較大體積細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,未來可以嘗試結(jié)合原位單細(xì)胞前處理流程以減少樣品損失并提高細(xì)胞分析通量。與此同時(shí),利用不同口徑毛細(xì)管進(jìn)行微區(qū)采樣,為亞細(xì)胞分辨率的單細(xì)胞研究帶來了便利和可能?；谝合嗌V的方法,其蛋白質(zhì)前處理步驟相對(duì)完整,但存在細(xì)胞通量相對(duì)較低和蛋白質(zhì)的覆蓋度低等問題。未來可以從發(fā)展低樣本吸附的方法,開發(fā)高通量單細(xì)胞分離技術(shù),借助標(biāo)記技術(shù)定量以及利用更高性能的質(zhì)譜儀器來實(shí)現(xiàn)分析結(jié)果的進(jìn)一步優(yōu)化。對(duì)于無分離模式下的質(zhì)譜直接分析方法,目前仍無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)大分子的直接檢測(cè),但利用免疫標(biāo)記探針和質(zhì)譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞上多個(gè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)。后續(xù)工作中,如何提高蛋白質(zhì)的分析通量、發(fā)展新型穩(wěn)定蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)以及信號(hào)輸出技術(shù)將是單細(xì)胞質(zhì)譜方法發(fā)展的關(guān)鍵?？梢?發(fā)展高通量的細(xì)胞分析策略,高蛋白覆蓋度以及具有空間分辨的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)將是該領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)和進(jìn)一步發(fā)展的方向。

4 總結(jié)與展望

通過對(duì)以上工作的梳理與思考,我們對(duì)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)行了展望。

首先,從多組學(xué)的角度對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行綜合分析將是未來單細(xì)胞技術(shù)的必由之路,驅(qū)動(dòng)力來自于人們?cè)絹碓叫枰獙?duì)細(xì)胞進(jìn)行綜合分析以及整體研判來解釋愈加復(fù)雜的生物學(xué)問題,進(jìn)而對(duì)疾病治療給出更為精確的方案?！蹲匀弧烦霭嫔鐚ⅰ皢渭?xì)胞多組學(xué)技術(shù)”評(píng)為“2019年度技術(shù)”,一些學(xué)者也對(duì)此表示了充分的贊同與肯定[62-64]。目前,在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域,將基因組以及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行結(jié)合的方法并不少見,而將轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)結(jié)合的代表性例子只有單細(xì)胞RNA測(cè)序方法CITE-seq[65]以及REAP-seq[66],這兩種方法都使用了寡聚核苷酸鏈偶聯(lián)的抗體來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)信號(hào)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的整合,但是蛋白鑒定數(shù)量不超過80種。由于種類多樣組成復(fù)雜,單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)的整合目前還未見報(bào)道?？紤]到質(zhì)譜強(qiáng)大的代謝物鑒定能力,未來基于質(zhì)譜的多組學(xué)技術(shù)具有非常大的研究潛力?？傊?發(fā)展單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù),解決蛋白質(zhì)信號(hào)如何與其他組學(xué)信息兼容問題,并最終實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析,是研究人員今后一段時(shí)間內(nèi)所要面臨的巨大挑戰(zhàn)。

其次,微流控技術(shù)的天然優(yōu)勢(shì)將為單細(xì)胞分析帶來高通量以及自動(dòng)化的可能,高通量大大縮減了樣品處理時(shí)間,而自動(dòng)化則減少了由于人為操作所帶來的少量樣品處理的可能誤差[67],這在處理大量細(xì)胞的過程中尤為重要。目前基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法多基于靜態(tài)液滴形式,因此在通量方面仍有很大的提高空間,利用微流控芯片強(qiáng)大的可操控性,在流路中對(duì)單細(xì)胞復(fù)雜的微環(huán)境進(jìn)行模擬以及實(shí)時(shí)改變外界刺激將會(huì)更真實(shí)地反應(yīng)體內(nèi)單細(xì)胞的生存環(huán)境以及變化過程[68],對(duì)于疾病的診斷與了解將會(huì)更加準(zhǔn)確與深入。與此同時(shí),發(fā)展微流控與質(zhì)譜的在線聯(lián)用技術(shù),無疑將使細(xì)胞通量以及靈敏度等得到進(jìn)一步提升。然而如何將不連續(xù)的蛋白質(zhì)前處理流程與連續(xù)的檢測(cè)相結(jié)合,充分發(fā)揮在線聯(lián)用高通量?jī)?yōu)勢(shì)的同時(shí),盡可能減少樣品損失將是必須解決的問題。此外,由于質(zhì)譜是目前單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必要工具,發(fā)展高性能的質(zhì)譜儀器,建立新的質(zhì)譜檢測(cè)方法以及與之配套的蛋白質(zhì)鑒定軟件等都將是領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。

當(dāng)然,除了方法本身的縱向發(fā)展外,與其他技術(shù)相結(jié)合的“橫向發(fā)展”也十分重要。例如在現(xiàn)有研究方法基礎(chǔ)上,進(jìn)行特定亞細(xì)胞區(qū)域的蛋白質(zhì)組學(xué)、相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)以及某種特定翻譯后修飾類型的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究等。這將有助于諸多生化過程以及致病機(jī)理的全新認(rèn)識(shí)與發(fā)現(xiàn),Slavov[69]在相關(guān)綜述中也表達(dá)了類似想法。

綜上,隨著基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜研究方法的不斷發(fā)展,單細(xì)胞分析方法的靈敏度、蛋白質(zhì)的覆蓋度、細(xì)胞通量、空間分辨率以及多組學(xué)的兼容能力會(huì)不斷突破我們的認(rèn)知極限。更重要的是,單細(xì)胞分析在臨床診斷、疾病分型以及細(xì)胞發(fā)展機(jī)制這些重大生命科學(xué)領(lǐng)域方面的應(yīng)用將會(huì)越來越廣泛。