陳頤輝 張寬朝 滕斌 張琛 張瑛

摘 ?要：以化感水稻品種‘PI312777’‘6173’和‘6180’為研究對象，從水稻根、莖和葉中分離獲得70株內(nèi)生真菌，采用形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS區(qū)序列分析，對內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定。進(jìn)一步以化感水稻‘PI312777’分離得到的粘紅酵母和塔賓曲霉為試驗菌株，通過不同稀釋倍數(shù)的真菌發(fā)酵液對非化感水稻進(jìn)行MS半固體培養(yǎng)基育苗試驗，研究化感水稻內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對非化感水稻萌發(fā)率、株高等形態(tài)指標(biāo)及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性的影響。結(jié)果表明，從供試化感水稻品種中共分離得到17種內(nèi)生真菌，經(jīng)rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定為10個屬，這些內(nèi)生真菌主要分布在曲霉屬（Aspergillus）（29.63%）、青霉屬（Penicillium）（16.67%）和鐮刀菌屬（Fusarium）（12.96%）。不同稀釋濃度塔賓曲霉發(fā)酵液對水稻幼苗生長均有促生作用，其中50倍稀釋濃度處理可顯著提高水稻幼苗的株高、根長及POD酶活性。粘紅酵母菌發(fā)酵液5倍稀釋濃度可顯著提高水稻幼苗的PAL酶活性并對水稻幼苗有促生作用。稗稻共生條件下，塔賓曲霉和粘紅酵母發(fā)酵稀釋液對水稻均有促生效應(yīng)。本研究可為化感水稻內(nèi)生真菌進(jìn)一步應(yīng)用于水稻生產(chǎn)實踐提供有益指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌;化感水稻;種類鑒定;酶活性

中圖分類號：S511;Q93 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Using allelopathic rice ‘PI312777’ ‘6173’ and ‘6180’ as the materials， 70 endophytic fungi were isolated from the roots， stems and leaves， and were further classified and identified by morphologic observation and rDNA ITS se-quence analysis. To study the effects of fungal fermentation products on the morphological indexes such as germination rate， stem height and phenylalanine ammonia lyase， catalase and peroxidase changes， Rhodotorula mucilaginosa and Aspergillus tabiensis isolated from allelopathy rice ‘PI312777’ were used as the experimental strains and their fermentation broth of different concentrations were used to carry out MS semi-solid medium seedling experiment on non-allelopathy rice. The results showed that 17 isolates of endophytic fungi and 10 genera were identified through rDNA-ITS sequence analysis. Aspergillus， Penicillium and Fusarium were the dominant species in allelopathic rice with the relative isolate frequency 29.63%， 16.67% and 12.96%， respectively. Different concentrations of A. tabiensis fermentation broth all promoted the growth of rice seedlings， among which the 50 times diluted concentration treatment significantly improved plant height， root length and POD activity of rice seedlings compared with the control treatment. High concentration of R. mucilaginosa fungus fermentation broth improved PAL activity of rice. Under the symbiotic condition of barnyard grass and rice， A. stabiensis and R. mucilaginosa both had promoting effects on the growth of non-allelopathic rice. The finding of this study could provide useful guidance for the further application of allelopathic endophytes in rice production.

Keywords： endophytic fungi; allelopathic rice; species identification; enzyme activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.029

植物內(nèi)生真菌（endophytes）是指在某一時期生活在宿主植物組織內(nèi)，卻不對宿主產(chǎn)生明顯有害癥狀，可與宿主植物建立互惠共存關(guān)系的一類微生物。植物為這些真菌提供生存環(huán)境，并為其提供光合產(chǎn)物和礦物等營養(yǎng)物質(zhì);內(nèi)生真菌則產(chǎn)生具有抗菌、抗氧化、抗蟲等生物活性的代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物能夠刺激植物生長發(fā)育，提高寄主植物抵御病害的能力，并且增加宿主植物的化感作用[1-3]。

水稻作為我國重要的禾谷類作物，具有豐富的內(nèi)生真菌資源，其種質(zhì)資源中存在具有化感潛力的品種[4]?；兴竞铣煞置诘姆铀犷悺Ⅴ?、萜烯類等物質(zhì)具有增強(qiáng)寄主植物應(yīng)對生物和非生物脅迫的能力[5-6]，而且其內(nèi)生真菌在與水稻長期共生的過程中，往往會形成一些新的化合物，同樣會對水稻生理代謝產(chǎn)生各種作用和影響[7]。因此，利用化感水稻內(nèi)生真菌，不僅能有效提高水稻產(chǎn)量，還可避免化學(xué)農(nóng)藥引起的環(huán)境污染，具有良好的應(yīng)用前景。

目前，水稻化感的研究主要集中于遺傳特性，化感物質(zhì)分離鑒定、作用方式及其機(jī)制等方面[5]。水稻內(nèi)生真菌研究多限于內(nèi)生聯(lián)合固氮菌以及水稻病害生防菌方面的篩選與應(yīng)用[7]，而對化感水稻內(nèi)生真菌的分類鑒定研究則很少。因此，發(fā)掘利用化感水稻內(nèi)生真菌資源，對于促進(jìn)水稻生長、提高水稻產(chǎn)量具有積極意義。近年來，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者采用形態(tài)與分子學(xué)相結(jié)合的方法對植物內(nèi)生菌分類鑒定進(jìn)行了研究。rDNA-ITS序列分析與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法，已被成功應(yīng)用于多種植物內(nèi)生真菌的分類鑒定[8-9]。本研究以4個水稻品種為材料，對其根、莖和葉組織中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離和種類鑒定，并采用來自化感水稻的內(nèi)生真菌，研究不同濃度真菌發(fā)酵液對非化感水稻生長和生理特性的影響。本研究可為進(jìn)一步挖掘利用化感水稻內(nèi)生真菌資源，闡明水稻內(nèi)生真菌的生理生態(tài)功能提供基礎(chǔ)資料。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所提供的3種化感水稻品種‘PI312777’‘6173’‘6180’，以及非化感水稻品種‘嘉興8號’以及稗草種子[10-11]。

培養(yǎng)基及試劑：水稻育苗采用MS培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[7]，滅菌后加入150 μg/mL青霉素和120 μg/mL鏈霉素以抑制細(xì)菌生長。青霉素、鏈霉素、乙醇、次氯酸鈉等分析純試劑購于國藥集團(tuán)，DNA聚合酶Taq酶、凝膠回收試劑盒均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?內(nèi)生真菌的分離純化 ?取水稻苗期的根、莖和葉片分別剪成1 cm長的3個小段，在無菌環(huán)境下，用無菌水將材料沖洗2～3次后取出，放入75%的乙醇中清洗30 s。隨后將樣品分別置于不同濃度的次氯酸鈉溶液（1%、2.5%、5%）中清洗1 min，取出后立即用無菌水漂洗4～5次[7]。隨后將無菌樣品分為2份，其中一份用組織分離法直接轉(zhuǎn)接到含有青霉素和鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，26 ℃下培養(yǎng)7 d;另一份用研缽將材料研磨成勻漿后，方法同上。將分離得到的不同內(nèi)生真菌接種到純化PDA培養(yǎng)基上，純化2次后獲得單菌落，置于4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.2 ?內(nèi)生真菌的鑒定 ?將純化菌株接種至PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)，觀察形態(tài)特征，包括菌落形態(tài)、顏色、子實體和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。同時通過擴(kuò)增分析真菌rDNA的ITS1序列，進(jìn)行分子鑒定，具體如下：收集菌絲，用改良的CTAB法提取菌株基因組DNA[12]。采用真菌通用引物ITS1（5-TCCG TAGGTGAACCTGCGC-3）和ITS4（5-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3）擴(kuò)增其5.8S rDNA-ITS序列[9]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，含DNA模板（50～ 500 ng/μL）2 μL，ITS1和ITS4（10 mmol/L）各2 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Taq聚合酶（5U/μL）1 μL，ddH2O 37 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán);72 ℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收、克隆并測序。測序結(jié)果在NCBI的Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對。

1.2.3 ?不同濃度化感水稻內(nèi)生真菌發(fā)酵液對水稻生長影響的測定 ?在上述研究結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇從化感水稻品種‘6173’中分離到的特屬內(nèi)生真菌粘紅酵母和塔賓曲霉，用于制備真菌發(fā)酵液。將無菌抽濾所得發(fā)酵液用無菌水分別稀釋成5、10、50倍3個濃度梯度。隨后，將非化感水稻品種‘嘉興8號’置于高溫滅菌后的培養(yǎng)皿中催芽至露白，繼續(xù)在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h施加不同濃度發(fā)酵液，待培養(yǎng)7 d后，對水稻種子萌發(fā)率、幼苗株高、根長及鮮重等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行測定。

向水稻‘嘉興8號’幼苗（3葉期）施加內(nèi)生真菌發(fā)酵液，并于48 h后測定水稻幼苗的過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。POD酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[13]，CAT酶活性采用紫外吸收法測定，PAL酶活性采用分光光度法測定[14]，每個處理重復(fù)3次。

1.2.4 ?內(nèi)生真菌生物學(xué)特性分析 ?以化感水稻‘6173’、非化感水稻‘嘉興8號’和稗草為研究材料，在溫室盆栽條件下，將‘嘉興8號’與稗草共栽培并施加目標(biāo)內(nèi)生真菌的發(fā)酵液處理作為試

驗組，再以‘6173’與稗草、‘嘉興8號’與稗草共同播種栽培作為對照組。待水稻生長至分蘗期時，測量3種植株材料的出苗率、分蘗數(shù)、株高、葉寬、根長、生物量等形態(tài)指標(biāo)，每個處理重復(fù)3次。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，應(yīng)用Duncan’s多重比較方法對多組樣本間平均數(shù)進(jìn)行比較，按照顯著性水平P<0.05判斷差異顯著性;采用Excel軟件進(jìn)行制圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?化感水稻內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

分離所得的內(nèi)生真菌經(jīng)2～3次純化后，最終從4種水稻材料中分離到70株內(nèi)生真菌。從表1可以看出，化感水稻與非化感水稻所攜帶的內(nèi)生真菌存在數(shù)量間差異。其中，從‘6173’分離到的內(nèi)生真菌總數(shù)最多，達(dá)23株;‘PI312777’次之，為18株。根、莖組織方面，從‘6173’中分離到的內(nèi)生真菌最多，分別為8和10株;葉片組織方面，從‘PI312777’分離到的內(nèi)生真菌最多，為6株。在4種化感水稻的根、莖、葉組織中分別分離到24、29和17株內(nèi)生真菌，占總分離真菌數(shù)的相對分離比率分別為34.29%、41.43%和24.28%，表明內(nèi)生真菌在化感水稻組織中的分布存在組織差異性。

2.2 ?水稻內(nèi)生真菌種類鑒定

通過菌落和形態(tài)學(xué)觀察，并對分離獲得的70株內(nèi)生真菌進(jìn)行rDNA-ITS序列分析，在4種供試水稻品種中共分離、鑒定到17種內(nèi)生真菌，這些真菌分屬3個亞門，10個屬。這些內(nèi)生真菌多數(shù)屬于子囊菌亞門和盤菌亞門，它們主要屬于這些亞門中的曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬等，還有部分屬于木霉屬、絲核菌屬和酵母屬的真菌（表2）。其中，從化感水稻品種‘PI312777’和‘6173’中分離得到的內(nèi)生真菌種類最多，分別為16種和14種。4個水稻品種中曲霉屬真菌所占比例分別為‘PI312777’27.78%、‘6173’26.09%、‘6180’46.15%、‘嘉興8號’37.5%，表明曲霉菌是水稻內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢菌群，其次是青霉屬共13株（18.57%）。從表2還可看出化感與非化感水稻中內(nèi)生真菌種類存在一定差異，鐮刀菌屬、黑曲霉、粘紅酵母、塔賓曲霉和麥角菌存在于化感水稻中，這其中黑曲霉是自然界廣泛分布的曲霉屬真菌，麥角菌為常見的植物病原真菌，根據(jù)上述情況，選擇來自化感水稻的內(nèi)生真菌粘紅酵母和塔賓曲霉進(jìn)行下一步的生物學(xué)效應(yīng)實驗。

2.3 ?不同濃度化感水稻內(nèi)生真菌發(fā)酵液對水稻生長的影響

從表3可以看出，與對照相比，不同濃度的塔賓曲霉發(fā)酵液對水稻幼苗的株高、根長和鮮重均有明顯促進(jìn)作用，且隨著發(fā)酵液濃度的降低，水稻幼苗表現(xiàn)出更好的生長態(tài)勢。在塔賓曲霉發(fā)酵液稀釋50倍處理組中，水稻幼苗株高達(dá)9.42 cm，顯著高于對照23.92 %，根長為5.67 cm，高于對照38.30%，且單株平均鮮重也高于對照18.95%;從粘紅酵母發(fā)酵液處理對水稻幼苗的生長影響來看，粘紅酵母發(fā)酵液稀釋5倍處理組中，水稻幼苗各項生理指標(biāo)均高于對照，差異顯著。10倍和50倍稀釋倍數(shù)發(fā)酵液處理組間幼苗株高、根長、鮮重，與對照相比，僅10倍稀釋處理組幼苗株高顯著長于對照，其他指標(biāo)均無顯著差異。不同稀釋濃度處理組之間比較，5倍稀釋倍數(shù)發(fā)酵液處理組水稻幼苗株高顯著高于其他處理組，并且高于對照。以上結(jié)果表明，塔賓曲霉和粘紅酵母發(fā)酵液對水稻的生長具有促進(jìn)作用，其中塔賓曲霉發(fā)酵液50倍稀釋濃度的作用效果最好。

2.4 ?不同濃度塔賓曲霉和粘紅酵母發(fā)酵液對水稻不同酶活性的影響

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物酚類代謝的限速酶。已有研究表明，在逆境脅迫下，水稻化感作用的強(qiáng)弱與其酚類化合物的總量和種類有關(guān)，因此苯丙氨酸解氨酶活性的調(diào)節(jié)可以誘導(dǎo)水稻化感作用的變化[15]。從圖1可以看出，塔賓曲霉處理組水稻幼苗的PAL酶活性略低于對照，但與對照無顯著性差異;3組不同稀釋濃度發(fā)酵液處理組之間酶活性差異也不顯著，表明塔賓曲霉發(fā)酵液處理不利于水稻幼苗PAL酶活性的提高。經(jīng)不同濃度的粘紅酵母發(fā)酵液處理后，非化感水稻的PAL酶活性均顯著高于對照，并且不同稀釋倍數(shù)的粘紅酵母發(fā)酵液處理組間PAL酶活性差異顯著，其中粘紅酵母發(fā)酵液5倍稀釋液處理組酶活性上升最迅速，其酶活性為對照的2.32倍，表明粘紅酵母菌發(fā)酵液5倍稀釋濃度處理對水稻化感作用的誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)。

從圖2可知，不同稀釋倍數(shù)的塔賓曲霉發(fā)酵液處理均對水稻幼苗POD酶活性產(chǎn)生積極的影響，3組水稻POD酶活性均顯著高于對照;3組不同濃度處理之間，水稻幼苗POD酶活性差異均不顯著;其中最大稀釋倍數(shù)的塔賓曲霉發(fā)酵液也可顯著提高水稻幼苗POD酶活性，酶活性為對照的1.36倍。以上結(jié)果表明，塔賓曲霉發(fā)酵液能夠提高水稻對脅迫的抵抗能力。粘紅酵母方面，各發(fā)酵液處理組的POD酶活性與對照相比差異均不顯著，但粘紅酵母發(fā)酵液5倍稀釋濃度處理組的幼苗POD酶活性顯著高于其他2組，表明高濃度的稀釋發(fā)酵液對水稻POD酶活性有促進(jìn)效應(yīng)。綜合以上試驗結(jié)果，認(rèn)為塔賓曲霉發(fā)酵液50倍稀釋濃度對水稻的生長和生理指標(biāo)的影響最為顯著，粘紅酵母發(fā)酵液5倍稀釋濃度能提高水稻PAL酶活性，提高水稻的化感潛力。

2.5 ?稗稻共生條件下塔賓曲霉及粘紅酵母發(fā)酵液對水稻幼苗生長的影響

從表4可以看出，化感水稻‘6173’的出苗率顯著高于其他3個處理組，施加內(nèi)生菌發(fā)酵液A和B試驗組的‘嘉興8號’出苗率也顯著高于其組內(nèi)對照。其中，粘紅酵母發(fā)酵液5倍稀釋液處理水稻的出苗率高于對照34.00%，而處理組中植株的分蘗數(shù)無明顯變化。施加塔賓曲霉發(fā)酵液50倍稀釋液的‘嘉興8號’水稻苗各項生理指標(biāo)均顯著高于對照，其單株株高和根長分別高于C處理組16.82%和7.37%。以上結(jié)果表明，稗稻共生條件下，塔賓曲霉和粘紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物對水稻幼苗生長具有較好的促生作用。

3 ?討論

3.1 ?內(nèi)生真菌的種類和分布

本研究中，供試水稻內(nèi)生真菌分離獲得比率的高低為：曲霉屬>青霉屬>鐮刀菌屬，表明曲霉屬是水稻的優(yōu)勢菌群，而曲霉屬和鐮刀菌屬真菌作為土壤中常見的真菌類群，其原因很可能是在水稻生長過程中從土壤傳播定殖到水稻組織中。田新莉等[16]從幾種常規(guī)水稻品種中分離內(nèi)生真菌結(jié)果表明，多數(shù)內(nèi)生真菌為鐮刀菌屬、青霉屬及曲霉屬，其中鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌群，這些內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生抑制水稻病原菌的次級代謝產(chǎn)物[17-19]，其代謝產(chǎn)物也可能會通過某種代謝途徑提高植物體的化感作用，進(jìn)而影響伴生雜草的生長[20]。本研究還從化感水稻‘PI312777’‘6173’中均分離到粘紅酵母。粘紅酵母已被證實能夠以苯丙氨酸為唯一碳源、氮源大量合成苯丙氨酸解氨酶，它是一種典型的胞內(nèi)誘導(dǎo)酶，能參與植物抗病、抗蟲害、抗逆境的生理作用，是植物體內(nèi)酚酸類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶[21]，它與水稻化感作用增強(qiáng)，酚酸類化感物質(zhì)增加有密切的聯(lián)系[22-23]。此外，本研究中僅從化感水稻中分離到了麥角菌，麥角菌代謝產(chǎn)物中的麥角堿毒素被認(rèn)為對伴生植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的化感效果[24]。以上表明，本研究所發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌種類較為豐富，可能參與形成了水稻的化感效應(yīng)。

3.2 ?塔賓曲霉和粘紅酵母發(fā)酵液對水稻生長的影響

本文從實際應(yīng)用出發(fā)，選擇不同稀釋濃度，著重研究了塔賓曲霉和粘紅酵母2種內(nèi)生真菌發(fā)酵液對水稻生長生理的影響。研究發(fā)現(xiàn)塔賓曲霉發(fā)酵液能明顯促進(jìn)水稻幼苗生長，提高水稻幼苗生物量。塔賓曲霉發(fā)酵液處理的水稻幼苗POD酶活性均高于對照組，這可能是因為其影響了水稻體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的平衡，使水稻體內(nèi)活性氧自由基維持在較低水平，從而能夠抑制細(xì)胞膜脂過氧化，維持膜的穩(wěn)定性，保持細(xì)胞正常生長代謝[25-26]。PAL作為水稻酚酸類化感物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，前期研究表明，逆境條件下水稻化感作用的增強(qiáng)與PAL酶活性升高有關(guān)，而高活性的PAL有利于促進(jìn)酚酸類物質(zhì)的合成和分泌[27-28]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，粘紅酵母發(fā)酵液5倍稀釋液能顯著提高幼苗期非化感水稻的PAL酶活性。盆栽試驗結(jié)果也表明，從化感水稻‘6173’中篩選出的2株內(nèi)生真菌對非化感水稻‘嘉興8號’均有一定的促生效應(yīng)，這可能是因為真菌代謝物會增強(qiáng)植株的抗逆性和增強(qiáng)其營養(yǎng)生理水平[16-17， 28]，塔賓曲霉發(fā)酵液50倍稀釋液對水稻的生長表現(xiàn)出直觀的促進(jìn)作用;粘紅酵母發(fā)酵液5倍稀釋液通過誘導(dǎo)水稻PAL活性，處理組中‘嘉興8號’長勢與化感水稻‘6173’持平。以上結(jié)果表明，塔賓曲霉和粘紅酵母內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對水稻生長有促進(jìn)作用。

4 ?結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的種類和群落結(jié)構(gòu)在化感水稻不同組織部位存在差異。通過經(jīng)典的形態(tài)分類鑒定并結(jié)合內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行分析，從供試水稻品種中共分離到17種內(nèi)生真菌，這些真菌分屬3個亞門，10個屬。在所分離的內(nèi)生真菌中，曲霉屬真菌為化感水稻優(yōu)勢菌群，其分離率達(dá)29.63%。從地方化感水稻品種‘6173’中分離篩選到的塔賓曲霉屬內(nèi)生真菌和粘紅酵母屬真菌菌株能夠促進(jìn)水稻生長和提高非化感水稻的化感潛力，表明化感水稻內(nèi)生真菌具有作為新型植物益生菌新資源的開發(fā)潛力，可進(jìn)一步應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，從而減少化肥和農(nóng)藥的使用量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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