張紹平，徐 怡

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院肝膽外科，重慶 401420)

膽囊癌是一種高侵襲性惡性腫瘤，盡管近年來(lái)膽囊癌的診治取得了巨大進(jìn)展，但是患者5年生存率仍不高[1],因此亟需尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄子，在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮作用。lncRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，與癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學(xué)行為有關(guān)。DILC是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA，DILC在不同組織中發(fā)揮的作用不同，在肝癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用[2-4]，在膽囊癌中發(fā)揮癌基因作用[5]。LIANG等[5]發(fā)現(xiàn)DILC在膽囊癌組織中表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲。DILC與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系如何，既往鮮有報(bào)道。本研究旨在觀察DILC在膽囊癌組織中的表達(dá)，并探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取80例膽囊癌組織標(biāo)本(膽囊癌組)和30例慢性膽囊炎組織標(biāo)本(對(duì)照組)，均于2011年1月至2018年12月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院接受診治。膽囊癌患者80例，男28例，女52例；年齡28～72歲，平均(62.02±10.32)歲，術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或免疫治療。術(shù)后以電話(huà)和門(mén)診方式對(duì)膽囊癌患者進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，隨訪時(shí)進(jìn)行影像學(xué)檢查。獲得生存情況、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況等內(nèi)容。隨訪時(shí)間截止至2019年6月。對(duì)照組患者30例，男12例，女18例；年齡31～58歲，平均(49.35±6.37)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織中DILC的表達(dá)。PCR步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用TRIzol試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)和AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司)提取膽囊癌和慢性膽囊炎組織中總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司)檢測(cè)DILC相對(duì)表達(dá)量。本研究引物均由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)并提供。DILC：上游5′-CGCACAGAGCAAAGCCATTT-3′；下游5′-GCAAGGGGCTAGAAGAAGGG-3′。內(nèi)參β-actin：上游5′-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3′；下游5′-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3′。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCq法計(jì)算DILC相對(duì)表達(dá)量。以DILC表達(dá)量的中位數(shù)為截?cái)嘀?，將膽囊癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染和侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)

膽囊癌細(xì)胞GBC-SD和人膽囊上皮細(xì)胞HGBEC購(gòu)于寧波明舟生物科技有限公司，將GBC-SD細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組加入DILC siRNA(5′-GGGCTTCAATTTACAAGCATT-3′)，陰性對(duì)照組加入無(wú)關(guān)序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。siRNA序列由上海吉馬制藥公司合成。操作步驟嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑盒(美國(guó)Sigma公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)收集細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)DILC的表達(dá)水平。用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，試劑盒購(gòu)于上海研拓生物科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后顯微鏡下計(jì)算穿膜次數(shù)，隨機(jī)取10個(gè)視野，取平均值[6]；用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后顯微鏡下取5個(gè)視野，測(cè)量劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距取平均值[6]。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌組織和膽囊癌細(xì)胞中DILC的相對(duì)表達(dá)量

膽囊癌組DILC相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.899，P<0.001)。GBC-SD細(xì)胞DILC相對(duì)表達(dá)量明顯高于HGBEC細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.265，P<0.001)。見(jiàn)封三圖1。

2.2 DILC表達(dá)與臨床、病理特征的關(guān)系

高表達(dá)組T分期為T(mén)3—T4期、TNM分期為Ⅲ—Ⅳ期的占比明顯高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 DILC表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 例

2.3 膽囊癌患者的生存分析

80例患者隨訪5～102個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為45個(gè)月。隨訪期間57例患者死亡，占71.25%，其中52例因腫瘤復(fù)發(fā)死亡，5例由于術(shù)后合并感染等非腫瘤因素死亡(作刪失數(shù)據(jù)處理)。80例膽囊癌患者術(shù)后生存時(shí)間為6～98個(gè)月，平均(28.4±5.34)個(gè)月。1年、2年、3年、5年生存率分別為：52.50%、36.25%、32.50%、22.50%。見(jiàn)封三圖2。

2.4 膽囊癌患者生存預(yù)后的COX多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，T分期(T3—T4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期(Ⅲ—Ⅳ)、DILC高表達(dá)是膽囊癌患者不良預(yù)后(生存時(shí)間)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 膽囊癌患者生存預(yù)后的單因素和COX多因素分析

2.5 DILC對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移的影響

轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)為(120.32±35.69)個(gè)·視野-1，明顯低于陰性對(duì)照組的(286.33±89.75)個(gè)·視野-1(P<0.001)，見(jiàn)封三圖3。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移距離為(6.32±0.55)pixel，明顯低于陰性對(duì)照組的(16.02±0.96)pixel(P<0.001)，見(jiàn)封三圖4。

3 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，臨床癥狀不典型，患者預(yù)后較差[7]。既往研究[8]顯示，膽囊癌患者5年生存率約5%，平均生存期13.2～19個(gè)月。本研究80例患者5年生存率為22.5%，術(shù)后生存時(shí)間為6～98個(gè)月，平均(28.4±5.34)個(gè)月。生存時(shí)間的延長(zhǎng)可能與膽囊癌診治手段的提高有關(guān)，但其總體生存時(shí)間仍不能令人滿(mǎn)意。

膽囊癌發(fā)病的生物學(xué)機(jī)制現(xiàn)在并未完全明確。LncRNA在膽囊癌中的作用越來(lái)越被重視，lncRNA與膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、自噬和化療敏感性等有關(guān)[9-11]，可能會(huì)成為膽囊癌早期診斷和預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物，是潛在的治療靶點(diǎn)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DILC與膽囊癌患者的腫瘤分期和生存預(yù)后密切相關(guān)。

DILC在多種癌癥中異常表達(dá)，DILC發(fā)揮的生物學(xué)作用具有組織特異性。MA等[3]發(fā)現(xiàn)，DILC可能通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲。在腎透明細(xì)胞癌的研究中，ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)DILC可能通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。DILC也能通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)抑制結(jié)腸癌進(jìn)展[2]。在膽囊癌中，DILC可能發(fā)揮癌基因作用。LIANG等[5]發(fā)現(xiàn)DILC在膽囊癌組織中表達(dá)上調(diào)，本研究結(jié)果與之一致，提示DILC在膽囊癌中發(fā)揮癌基因作用。另，本研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組T分期為T(mén)3—T4期、TNM分期為Ⅲ—Ⅳ期的占比明顯高于低表達(dá)組(P<0.05)，提示DILC與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)。影響膽囊癌預(yù)后的因素有很多，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與膽囊癌患者生存時(shí)間有關(guān)，這與既往報(bào)道[14-15]一致。DILC高表達(dá)同樣是膽囊癌患者不良預(yù)后(生存時(shí)間)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這可能與DILC促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移距離均低于陰性對(duì)照組(P<0.001)，這也提示DILC在膽囊癌中的生物學(xué)機(jī)制目前尚未明了，可能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲[5]。

綜上所述，DILC在膽囊癌組織中高水平表達(dá)，并且與腫瘤分期和生存預(yù)后有關(guān)。DILC可以促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移，其對(duì)膽囊癌作用的機(jī)制需要未來(lái)進(jìn)行深入探討。