楊培培，李鐵柱，周金鑫，王忠海

(沈陽(yáng)積水潭醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110027)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是多種病因?qū)е嘛B內(nèi)血管破裂，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔而形成的腦血管疾病，其發(fā)病率和死亡率均較高[1]。SAH后常出現(xiàn)早期腦損傷(early brain injury，EBI)，若得不到有效控制，2～3周后會(huì)發(fā)展成慢性腦積水。腦積水是SAH患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，主要是由于出血造成應(yīng)激、炎癥反應(yīng)刺激軟腦膜發(fā)生纖維化病變，局部組織發(fā)生纖維化黏連，使腦脊液吸收減少，循環(huán)受阻所致[2]。因此，減輕SAH后軟腦膜纖維化，在降低SAH后發(fā)生慢性腦積水中具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由19～24個(gè)核苷酸組成，能結(jié)合到目標(biāo)mRNA上，進(jìn)而抑制mRNA的翻譯及功能，促進(jìn)相應(yīng)mRNA降解。miRNA還可靶向結(jié)合到基因啟動(dòng)子特定區(qū)域并誘導(dǎo)基因表達(dá)[3]。miR-134是一種大腦特異性miRNA，與樹(shù)突和突觸棘的發(fā)育有關(guān)。據(jù)報(bào)道[4]，miR-134在缺血性損傷的腦組織中異常表達(dá)，提示miR-134在調(diào)節(jié)腦缺血損傷中的潛在關(guān)鍵作用。也有研究[5]表明miR-134能夠靶向結(jié)合到STAT5B的3’UTR區(qū)域，在肝纖維化中發(fā)揮重要作用。但是目前沒(méi)有關(guān)于miR-134在SAH后軟腦膜纖維化過(guò)程中作用的研究。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，SAH后腦脊液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達(dá)水平顯著升高，提示TGF-β1與慢性腦積水的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。TGF-β1是TGF-β家族成員，作為一種有效的促纖維化因子，能夠通過(guò)與細(xì)胞表面的TGF-β Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合，激活Smad2/3的磷酸化，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生[7]。但是目前尚未見(jiàn)miR-134和TGF-β1在SAH后軟腦膜纖維化過(guò)程中的作用研究。本研究旨在探究miR-134在SAH后軟腦膜纖維化中的作用及其機(jī)制，為預(yù)防、治療SAH后腦積水的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所有實(shí)驗(yàn)方案均獲得北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有動(dòng)物程序均按照國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》(2011年)第8版進(jìn)行。雄性SD大鼠40只(6周齡，體質(zhì)量160～180 g)購(gòu)自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物部。按照隨機(jī)對(duì)照表法將大鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組(SHAM組)和模型組(SAH組)，每組各20只。大鼠置于23～25 ℃、70%濕度和12 h光/暗循環(huán)的安靜室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

SuperScriptⅢ試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；iTaqTM Universal SYBR Green Supermix購(gòu)自BIO-RAD；血管內(nèi)皮細(xì)胞系RAOEC細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)ATCC；Dual-Luciferas雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素雙抗、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；抗體TGF-β1、Collagen Ⅰ和GAPDH購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000、無(wú)意義小鏈、miR-134+反義鏈miR-134、miR-134、BCA蛋白定量試劑、ECL發(fā)光劑購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；空載體慢病毒、Lv-miR-134、Lv-TGF-β1和Lv-miR-134+siRNA-TGF-β1購(gòu)自于上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司。

1.3 大鼠SAH模型建立

大鼠麻醉后動(dòng)脈插管，仰臥位置于加熱墊上，以保持體溫在(36.5±0.5)℃。在枕骨大孔的中心作一1.0～1.5 cm長(zhǎng)的縱向正中枕下切口，切開(kāi)頸部肌肉直到看到硬腦膜。自股動(dòng)脈抽取自體未抗凝動(dòng)脈血0.5 mL，用25號(hào)蝶形針將其注入大池。然后，將大鼠以45°角放置在傾斜板上，頭部朝下，保持中立位置30 min(此定義為第0天)。24 h后用相同程序再次注射血液。SHAM組大鼠接受類(lèi)似處理，但注射PBS。造模7 d后處死大鼠，獲取腦組織。

1.4 基因芯片檢測(cè)

隨機(jī)選取SHAM組和SAH組大鼠腦組織標(biāo)本(1 cm×1 cm×1 cm)各3例，剪碎置于1 mL Trizol裂解液中，提取總RNA，并送至上海豐核信息科技有限公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

組織或細(xì)胞中加入適量的Trizol裂解液，提取總RNA。采用SuperScriptⅢ試劑盒說(shuō)明書(shū)合成第一條鏈cDNA，以合成的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，參數(shù)為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s循環(huán)40次，60 ℃延伸1 min。引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

血管內(nèi)皮細(xì)胞系RAOEC加入含有10% FBS DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，當(dāng)細(xì)胞密度30%時(shí)，轉(zhuǎn)染無(wú)意義小鏈(Con組)、miR-134+反義鏈miR-134(miR-134+AS組)、miR-134(miR-134組)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

用TGF-β1上、下游特異性引物擴(kuò)增TGF-β1的3′UTR序列。將pMIR-REPORT-Luciferase載體進(jìn)行Spe Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切。利用連接酶將TGF-β1的3′UTR序列與pMIR-REPORT-Luciferase載體連接，命名為pMIR-LUC-TGF-β1。當(dāng)RAOEC細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，接種于96孔板，達(dá)到70%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將已合成的pMIR-LUC-TGF-β1和pRL-TK分別轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)染了無(wú)意義小鏈(Con組)、miR-134+反義鏈miR-134(miR-134+AS組)、miR-134(miR-134組)的RAOEC細(xì)胞中。24 h后，PBS洗滌2次，裂解緩沖液裂解細(xì)胞，加入LAR Ⅱ，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，隨后立即加入海腎熒光素酶底物Stop & Glo Reagent，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定海腎熒光。

1.8 Western blot

造模后第7 d分離腦組織，置于含有150 mmol·L-1NaCl、50 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1乙二胺四乙酸、0.1%吐溫-20、1%Triton X-100、0.1%β-巰基乙醇、0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物、5 mg·mL-1亮蛋白和5 mg·mL-1抑肽酶的緩沖液中，在4 ℃下以10 000×g離心10 min，并收集上清液，得到蛋白樣品。miR-134過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞系培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期按照細(xì)胞全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行全蛋白提取。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，用15% SDS-PAGE分離30 μg全蛋白，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用TBST配置5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1：1000稀釋的抗體TGF-β1、Collagen Ⅰ和GAPDH，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST室溫洗3次。加入二抗室溫孵育1 h。在暗室里，按照1：1的比例混合發(fā)光底物A、B液。取出膜放入Bio-Rad顯像儀。保存圖片并使用Quantity One分析軟件對(duì)圖像灰度進(jìn)行分析。

1.9 軟腦膜Masson染色

將12只SAH大鼠隨機(jī)分為4組，即空白慢病毒組、Lv-miR-134組、Lv-TGF-β1組和Lv-miR-134+siRNA-TGF-β1組，每組3只。向大鼠顱骨后注射空白慢病毒、Lv-miR-134、Lv-TGF-β1和Lv-miR-134+siRNA-TGF-β1各5 μL，緩慢注射6 min，并留針5 min，飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行SAH手術(shù)。大鼠4%多聚甲醛灌注后取腦OTC包埋，取帶腦膜腦組織，bonius氏液中固定2 h，室溫晾干后，按照Masson染色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取400倍下頂部及外側(cè)邊緣格3個(gè)相同部位視野，利用Image pro pluse軟件測(cè)量軟腦膜纖維化程度，即(100×厚度)/灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNAs的篩選

miRNA芯片分析結(jié)果顯示，SAH組樣本中miR-134表達(dá)顯著低于SHAM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-134 mRNA在腦組織中的表達(dá)比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，SAH組中miR-134 mRNA表達(dá)量低于SHAM組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 miR-134靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果

miRDB軟件分析結(jié)果顯示，miR-134能夠結(jié)合到TGF-β1的3′UTR區(qū)域。見(jiàn)圖3。

熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，miR-134組抑制TGF-β1的活性，而miR-134+AS組對(duì)TGF-β1活性的抑制作用消失，提示miR-134結(jié)合TGF-β1啟動(dòng)子的特定區(qū)域調(diào)節(jié)TGF-β1活性。見(jiàn)圖4。

2.4 TGF-β1和Collagen Ⅰ在腦組織中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與SHAM組比較，SAH組的TGF-β1和Collagen Ⅰ的mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖5；Western blot結(jié)果顯示，SAH組的TGF-β1和Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)高于SHAM組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

2.5 血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-134對(duì)TGF-β1和Collagen Ⅰ表達(dá)的影響

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與Con組比較，miR-134組抑制了TGF-β1的表達(dá)，而miR-134+AS組增加了Collagen Ⅰ的mRNA和蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖7—8。

2.5 miR-134/TGF-β1對(duì)SAH后軟腦膜纖維化的作用

空白慢病毒組、Lv-miR-134組、Lv-TGF-β1組和Lv-miR-134+siRNA-TGF-β1組的纖維化灰度值分別為64.131±0.837、42.266±1.236、82.588±1.938、21.337±1.670。與空白慢病毒組相比，Lv-miR-134組和Lv-miR-134+siRNA-TGF-β1組纖維化程度降低(P<0.05)，而Lv-TGF-β1組纖維化程度升高(P<0.05)

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)SAH后約7%～48%發(fā)生慢性腦積水，可導(dǎo)致顱內(nèi)壓顯著升高，對(duì)腦實(shí)質(zhì)造成嚴(yán)重?fù)p傷，包括引起軟腦膜結(jié)構(gòu)發(fā)生纖維化病變[8]。研究表明，眾多miRNA在腎纖維化、肝纖維化、心房纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[9-11]。同時(shí)，在SAH后腦積水研究中發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)失調(diào)與腦膜纖維化程度密切相關(guān)。因此，差異表達(dá)的miRNA可能成為治療和預(yù)防SAH后腦積水的靶點(diǎn)[12-13]。成利等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-29c可通過(guò)TGF-β1/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與軟腦膜纖維化程度。因此，本研究首先通過(guò)基因芯片技術(shù)在大鼠SHAM和SAH樣本組織中篩選出差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-134呈顯著差異表達(dá)，同時(shí)RT-qPCR證實(shí)了這一結(jié)果。miR-134位于D1K1/Dio3印記基因區(qū)域的miRNA簇中，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，可以調(diào)節(jié)由氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧引起的神經(jīng)元死亡[12]，提示miR-134在調(diào)節(jié)腦缺血損傷中的潛在作用，但是miR-134在SAH后軟腦膜纖維化過(guò)程中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，本研究發(fā)現(xiàn)miR-134能夠靶向結(jié)合TGF-β1；同時(shí)，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-134可以通過(guò)直接與TGF-β1結(jié)合而調(diào)節(jié)TGF-β1的活性。TGF-β1在多個(gè)組織器官的纖維化中發(fā)揮作用，包括SAH后的軟腦膜纖維化。有研究[15]顯示，盡管健康人的腦脊液中只發(fā)現(xiàn)微量的TGF-β1，但SAH患者中TGF-β1水平顯著上調(diào)。另有研究[16]認(rèn)為，在SAH大鼠的腦脊液中TGF-β1的濃度顯著升高，可作為SAH后軟腦膜纖維化的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)SAH組織中TGF-β1和Collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表達(dá)量均高于SHAM組；此外，在血管內(nèi)皮細(xì)胞系中，本研究發(fā)現(xiàn)miR-134能夠抑制TGF-β1和CollagenI的表達(dá)；而且，Masson染色證實(shí)，miR-134/TGF-β1能影響SAH后軟腦膜纖維化的程度，提示miR-134負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β1，抑制Collagen Ⅰ的表達(dá)，從而抑制軟腦膜的纖維化程度。

綜上，本研究從動(dòng)物和細(xì)胞水平證實(shí)miR-134負(fù)向調(diào)控TGF-β1，抑制纖維化Collagen Ⅰ的表達(dá)，進(jìn)而抑制SAH后軟腦膜的纖維化進(jìn)展，表明miR-134可能是預(yù)防、治療SAH后慢性腦積水潛在治療靶點(diǎn)。